鉄酸化細菌の鉄酸化酵素遺伝子のクロ-ニングと鉄酸化細菌への導入

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63560094
• Research Institution: Akita Prefectural College of Agriculture
• Principal Investigator: 草野 友延 秋田県立農業短期大学, 附属生物工学研究所, 助教授 (40186383)
• Keywords: 鉄酸化細菌 / 鉄酸化酵素遺伝子 / クロ-ニング

Research Abstract

1.標記酵素は鉄酸化細菌Fe1株よりSDSーPAGE的に均一に精製され、N末端のアミノ酸配列が決定されている。東工大山中教授からの私信に基ずき、18merと21merの2種のオリゴヌクレオチドを化学合成しプロ-ブとして用いた。
2.Fe1株の染色体DNAを調整し、EcoRI,PstIのプラスミドライブラリ-を構築した。これらのライブラリ-より1で述べたプロ-ブを用いて4c22塩基対からなるEcoRI断片として目的クロ-ンを単離した。
3.塩基配列決定の結果、目的遺伝子は255塩基対の短い読み枠を有していた。84ケのアミノ酸配列のうち31ケはシグナル配列を形成し、成熟酵素のサブユニット部分はわずか53ケのアミノ酸よりなっていた。これは、精製酵素サブユニットの分子量が8,000以下である事とも一致した結果である。
4.現在、大腸菌用発現ベクタ-にのせて大腸菌での本酵素の発現を試みている。
5.得られた4Kbの断片上には目的遺伝子の他に1290塩基対よりなるプリン生合成に関与するpurA遺伝子も存在している事が判明している。
6.鉄酸化細菌の宿主ベクタ-系構築に必要な選択マ-カ-遺伝子として、Eー15株由来の水銀耐性遺伝子を単離し、遺伝子構成を明らかにした。現在、この遺伝子を用いてシャトルベクタ-の構築、導入を試みている。

Research Products

• [Publications] 白鳥,井上,菅原,草野,北川: "Cloning and expression of Thiobacillus ferrooxidans mercury ion resistance genes in Eschorichia cdi" Journal of Bactericlogy. 171. 3458-3464 (1989)
• [Publications] 草野,北川: "鉄酸化細菌への遺伝子の導入" 化学と生物. 26. 351-353 (1988)
• [Publications] 井上,菅原,白鳥,草野,北川: "Nucleotide sequence of the Thiobacillus ferrooxidans chromosomal gene encoding mercuric reductase." Gene. 84. 47-54 (1989)
• [Publications] 竹島、井上,北川,草野: "Nuclcolide sequence of a Thiobacillus ferrooxidans chromosomal gene,which encodcs putative RXIA comporcnt of RN asep." Nucleic Acids Research. 17. 9482-1 (1989)
• [Publications] 草野,Ji,井上,Silver: "Constitutive synthesis of a transport function encoded by the merC gene of Thiobacillus ferrooxidans"
• [Publications] 井上,菅原,北川,草野: "Thiobacillus mer operon:sequence analysis of the promoter and adjacent genes,"