1988 Fiscal Year Annual Research Report
アミノ酸ラセマーゼのタンパク質構造と触媒機構の解明
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63580152
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
谷澤 克行 京都大学, 化学研究所, 助手 (20133134)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 助手 (50135597)
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| Keywords | ラセマーゼ / ピリドキサル酵素 / アラニン / グルタミン酸 / タンパク質構造 / ラセミ化 / 全一次構造 |
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| Research Abstract |
アラニンラセマーゼは、DーおよびLーアラニンのラセミ化反応を触媒するピリドキサル酵素である。本酵素は原核生物に広く存在し、細胞壁ペプチドグリカン中のDーアラニンの生合成に中心的な働きをしている。このため、新規抗生物質のデザインのための標的酵素として、その構造と触媒機構を解明することは極めて重要である。本研究では、中等度好熱性細菌、Bacillus stearothermophilusのアラニンラセマーゼ遺伝子をクローン化し、そのDNA配列と酵素タンパク質のトリプシン消化ペプチド断片のアミノ酸配列とから、本酵素の全一次構造を解明した。また高発現プラスミドを構築して大腸菌内で大量の発現させ、耐熱性を利用する迅速酵素精製法を確立するとともに、単結晶を調製してX線結晶解析を開始した。本酵素は、分子量が約80,000で、386個のアミノ酸残基からなるサブユニット2個から構成されていることが判明した。本酵素は420nmに吸収極大を有するピリドキサル酵素特有の吸収スペクトルを示すとともに、この吸収領域において負の円二色性ピークを有していた。本酵素はアラニンに特異的に作用し、セリン、バリン、リジンなど他のアミノ酸は全く基質とならなかった。塩酸グアニジンによる本酵素タンパク質の変性過程を円二色性スペクトルにより追跡した結果、本酵素サブユニットが安定性の異なる大小2個のドメインから構成されていることが示唆された。また、本酵素は高い耐熱性を有するのみならず、ズブチリシンやパパインなどのタンパク質消化酵素により10ケ所以上の部位で切断を受けても、全くその活性を失わないという興味ある知見が得られた。一方、乳酸菌のグルタミン酸ラセマーゼについてもその全一次構造を解明し、アラニンラセマーゼの一次構造と比較した結果、ほとんど相同性は認められなかった。このことは、両酵素が補酵素要求性の点でも大きく異なる事実と一致する。
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