タンパク質間相互作用解析とイメージングに基づく繊毛形成と繊毛内輸送機構の解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Cilium-centrosome system regulating biosignal flows
• Project/Area Number: 15H01211
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (40192679)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 細胞・組織 / シグナル伝達 / 繊毛

Outline of Annual Research Achievements

繊毛内には、多数のタンパク質が特異的に局在し、それらの輸送は厳密に制御されている。このような繊毛内タンパク質輸送は、多数のサブユニットからなるいくつかのタンパク質複合体（IFT-A、IFT-B、BBSome複合体）が、キネシンやダイニンのようなモータータンパク質と共同して機能するすることによって媒介される。
私たちが新たに開発したタンパク質間相互作用解析法（VIPアッセイ：Vissible Immunoprecipitation）を活用して、平成27年度には、BBSome複合体（８サブユニットからなる）、およびIFT-B複合体（16サブユニットからなる）の極めて複雑な構築様式を解明した。特に、IFT-B複合体は、10サブユニットからなるコアサブ複合体と６サブユニットからなるペリフェラルサブ複合体に分けられ、これまではIFT-B複合体に含まれるのかどうかも不明であったTTC26とCluap1（IFT56とIFT38と再命名）がそれぞれのサブ複合体に含まれることを証明した。さらに、IFT38に関しては、ノックアウトマウス由来の繊維芽細胞を用いて、IFT38が繊毛形成にとって必須であること、およびその繊毛形成にはIFT38がIFT-Bのペリフェラル複合体に含まれることが必須であることを証明した。
このような構築様式の解明は、繊毛内タンパク質輸送複合体に関する今後の機能研究において大いに役立つと考えられる。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

平成26年度に開発したVIPアッセイが予想以上に洗練され、平成27年度にはこのアッセイ法を活用したタンパク質間相互作用解析が予想以上に進展した。このアッセイが当初予想していたよりもはるかに複雑なタンパク質間相互作用に解析にも応用可能であることがわかり、BBSome複合体とIFT-B複合体の極めて複雑な構築様式を解明することができた。他にも、細胞内タンパク質輸送に関与するExocyst複合体（8サブユニットからなる）の構築様式の解明にも成功している。これらの複合体の構築様式は、VIPアッセイの開発なしには不可能であったことから、当初の計画以上に進展していると判断する。さらに、このような構築様式の解明は、繊毛内タンパク質輸送複合体に関する今後の機能研究において大いに役立つと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度には、以下のことを明らかにする。
１．8サブユニットからなるIFT-A複合体の構築様式も解明する。これまで、IFT-A複合体の構築様式の解明が難航していた理由の一つとして、この複合体のサブユニットがいずれも大きいためにcDNAのクローニングが難しい点があった。しかし、この問題が克服できたので、VIPアッセイを活用して、IFT-A複合体の構築様式の解明がすぐに進むと予想される。
２．IFT-B複合体にはキネシンファミリーのモータータンパク質のkinesin-2およびKIF17が結合して、IFT-B複合体の繊毛内輸送を媒介することが知られている。しかし、これらのキネシンがIFT-B複合体にどのサブユニットを介して結合するのかや、IFT-Bの繊毛内輸送にどのようにかかわるのかはわかっていない。そこで、VIPアッセイによってこの結合の様式を明らかにする。
３．IFT-B複合体には、低分子量GTPaseのArl13bが結合することも知られている。しかし、Arl13bがIFT-B複合体にどのサブユニットを介して結合するのかはわかっていない。そこで、VIPアッセイによってこの結合の様式を明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] Class I Arfs (Arf1 and Arf3) and Arf6 are localized to the Flemming body and play important roles in cytokinesis (2016)
  • Author(s): Hanai, A., Ohgi, M., Yagi, C., Ueda, T., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Biochem. Volume: 159 Pages: 201-208
  • DOI: 10.1093/jb/mvv088
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Modulation of ciliary length by melanin-concentrating hormone receptor 1. (2016)
  • Author(s): Hamamoto, A., Yamato, S., Katoh, Y., Nakayama, K., Yoshimura, K., Takeda, S., Kobayashi, Y. & Saito, Y.
  • Journal Title: Cell. Signal. Volume: 28 Pages: 572-584
  • DOI: 10.1016/j.cellsig.2016.02.018
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] GM130 is a parallel tetramer in a flexible rod-like structure and N-terminally open (Y-shaped) and closed (I-shaped) conformations. (2015)
  • Author(s): Ishida, R., Yamamoto, A., Nakayama, K., Sohda, M., Misumi, Y., Yasunaga, T. & Nakamura, N.
  • Journal Title: FEBS J. Volume: 282 Pages: 2232-2244
  • DOI: 10.1111/febs.13271
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Architectures of multisubunit complexes revealed by a visible immunoprecipitation assay using fluorescent fusion proteins. (2015)
  • Author(s): Katoh, Y., Nozaki, S., Hartanto, D., Miyano, R. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 128 Pages: 2351-2362
  • DOI: 10.1242/jcs.168740
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Phospholipid flippase ATP10A translocates phosphatidylcholine and is involved in plasma membrane dynamics. (2015)
  • Author(s): Naito, T., Takatsu, H., Miyano, R., Takada, N., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 290 Pages: 15004-15017
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.655191
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] SNAP23/25 and VAMP2 mediate exocytic event of transferrin receptor-containing recycling vesicles. (2015)
  • Author(s): Kubo, K., Kobayashi, M., Nozaki, S., Yagi, C., Hatsuzawa, K., Katoh, Y., Shin, H.-W., Takahashi, S. & Nakayama, K.
  • Journal Title: Biol. Open Volume: 4 Pages: 910-920
  • DOI: 10.1242/bio.012146
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] COPI-mediated retrieval of SCAP is crucial for regulating lipogenesis under basal and sterol-deficient conditions. (2015)
  • Author(s): Takashima, K., Saitoh, A., Funabashi, T., Hirose, S., Yagi, C., Nozaki, S., Sato, S., Shin, H.-W. & Nakayama, K.
  • Journal Title: J. Cell Sci. Volume: 128 Pages: 2805-2815
  • DOI: 10.1242/jcs.164137
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] ATP11C mutation is responsible for the defect in phosphatidylserine uptake in UPS-1 cells. (2015)
  • Author(s): Takada, N., Takatsu, H., Miyano, R., Nakayama, K. & Shin, H.-W.
  • Journal Title: J. Lipid Res. Volume: 56 Pages: 2151-2157
  • DOI: 10.1194/jlr.M062547
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ホスファチジルセリン取り込み異常のCHO-K1変異株（UPS-1）におけるflippaseの発現解析． (2015)
  • Author(s): 高田直人、高津宏之、宮野吏永、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの構築様式とCLUAP1の機能の解明． (2015)
  • Author(s): 寺田将也、加藤洋平、野崎梢平、武井領汰、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 中心体/基底小体で複合体を形成するRabL2とCep19の機能の解析． (2015)
  • Author(s): 西島侑哉、萩谷遥平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体から小胞体への逆行輸送による脂質代謝の調節． (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申惠媛、中山和久
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Visible immunoprecipitation（VIP）アッセイによるExocyst複合体の構築様式の解明． (2015)
  • Author(s): 野崎梢平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] COPI被覆小胞を介するSCAP-SREBP複合体のゴルジ体-小胞体間の逆行輸送による脂質代謝調節． (2015)
  • Author(s): 船橋輝記、高島皓平、齋藤明奈、廣瀬祥平、申 惠媛、中山和久
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性および細胞膜ダイナ ミクスへの関与． (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申 惠媛
  • Organizer: 第14回 次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2015
  • Place of Presentation: 千葉
  • Year and Date: 2015-09-12 – 2015-09-13
• [Presentation] Architectures of the BBSome, IFT-B, and Exocyst Complexes Revealed by Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay Using Fluorescent Fusion Proteins. (2015)
  • Author(s): Nakayama, K., Katoh, Y., Nozaki, S., & Terada, M.
  • Organizer: FASEB Science Research Conference, “Biology o f Cilia and Flagella”
  • Place of Presentation: Snowmass Village, Colorado,
  • Year and Date: 2015-07-19 – 2015-07-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Visible immunoprecipitation (VIP) アッセイによるマルチサブユニット複合体の構築様式の解明 (2015)
  • Author(s): 加藤洋平、野崎梢平、寺田将也、中山和久
  • Organizer: 第67回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [Presentation] リン脂質フリッパーゼATP10AのPCフリップ活性及び細胞膜ダイナミクスへの関与． (2015)
  • Author(s): 内藤朋樹、高津宏之、宮野吏永、高田直人、中山和久、申惠媛
  • Organizer: 第62回日本生化学会近畿支部例会
  • Place of Presentation: 草津
  • Year and Date: 2015-05-16