計画的細胞死に共役した細胞内小胞輸送の改変と細胞外シグナルの生成

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Homeostatic Regulation by Various Types of Cell Death
• Project/Area Number: 15H01382
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 鎌田 英明 広島大学, 医歯薬保健学研究院(医), 准教授 (10233925)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: TNF / アポトーシス / ネクロプトーシス / 細胞内小胞輸送 / Rab11b / RIPK3

Outline of Annual Research Achievements

腫瘍壊死因子(TNFα)はIκBキナーゼ(IKKβ)を介してNF-κBを活性化するが、NF-κBが活性化されない細胞ではカスパーゼが活性化されてアポトーシスが誘導される。またカスパーゼの活性化が誘導されないときにはRIPK1、RIPK3、MLKLを介したネクロプトーシスが誘導されてDAMPsやサイトカインの放出にいたる。我々はTNFαによる細胞死と細胞内小胞輸送系を制御するRab11Bが密接に連関する事を見いだした。まずNF-κBの主要構成サブユニットRelAを欠損する細胞をTNFαで処理してカスパーゼを活性化すると、Rab11BのC末領域が切断されて膜から解離して分解されることを見いだした。さらにカスパーゼを抑制した条件化でネクロプトーシスを誘導すると、RIPK1やRIPK3から構成される複合体にRab11Bが会合することが確認された。またアポトーシスの誘導によりRIPK3はカスパーゼで分解される。これに対してネクロプトーシスによりRIPK3は細胞外に放出されるが、この過程をGFPで標識したRIPK3タンパク質を用いて蛍光顕微鏡下で実時間解析したところ、細胞膜の崩壊前と崩壊後に二つの過程でRIPK3は細胞外に放出さることや、細胞膜崩前の過程にRab11Bが関与することが判明した。さらにRab11Bのカスパーゼによる切断部位に変異を導入したノックインマウスと、Rab11B遺伝子にLoxＰ配列を導入したマウスを作成した。このマウスから細胞を取得して細胞死の応答を解析すると主に、Rab11Bと炎症と発がんとの連関を解析する予定である。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本研究では細胞内小胞輸送と細胞死との連関を解析することを目的としてRab11Bとアポトーシスおよびネクロプトーシスの関連を解析してきた。これまでの研究によりRab11Bのカスパーゼによる切断部位を同定するとともに、この切断に関与するカスパーゼを生化学的に同定することができた。さらにネクロプロ-シスにともなうRIPK3タンパク質とRab11Bの特異的な会合を確認した。さらにRIPK3の細胞内局在変化についての実時間解析により、RIPK3の細胞外放出へのRab11Bの関与を観察することにも成功した。そこで当初の計画に従い、カスパーゼの切断を受容しないRab11Bのノックインマウスの作成に取りかかり、現時点でカスパーゼ耐性のRab11B変異アレルをホモで有するマウスの作成に成功した。さらにRab11Bと細胞死との関連を明らかにするために、Rab11Bのコンディショナナルノックアウトマウスの作成にとりかかり、このマウスについても作成できたことが確認できた。Rab11Bのノックインマウスだけでなく、Rab11Bのコンディショナナルノックアウトマウスの作成も順調に進行し、さらに蛍光顕微鏡による実時間解析のデータも得られたことから、当初の計画以上に研究は進行していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

当初の研究計画に従い、これまでに作成したRab11Bのカスパーゼによる切断部位に変異を導入したノックインマウスの炎症と発がんの応答を解析すると共に、取得した細胞を用いてRab11bと細胞死の連関の分子機構を解析する。Rab11B遺伝子にLoxＰ配列を導入したマウスを作成したマウスについて、これを　Cre発現マウスと交配して肝細胞特異的なノックアウトマウスを作成して、肝細胞死の応答を解析するとともに、炎症と発がんとの連関を解析し、この分子機構を解明してゆく予定である。

Research Products

• [Journal Article] Involvement of resistin-like molecule β in the development of methionine-choline deficient diet-induced non-alcoholic steatohepatitis in mice. (2016)
  • Author(s): Okubo H, Kushiyama A, Sakoda H, Nakatsu Y, Iizuka M, Taki N, Fujishiro M, Fukushima T, Kamata H, Nagamachi A, Inaba T, Nishimura F, Katagiri H, Asahara T, Yoshida Y, Chonan O, Encinas J, Asano T.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Pages: 20157
  • DOI: 10.1038/srep20157
• [Journal Article] HECT‐Type Ubiquitin E3 Ligase ITCH Interacts With Thioredoxin‐Interacting Protein and Ameliorates Reactive Oxygen Species Induced Cardiotoxicity (2016)
  • Author(s): Yoichiro Otaki, Hiroki Takahashi, Tetsu Watanabe, Akira Funayama, Shunsuke Netsu, Yuki Honda, Taro Narumi, Shinpei Kadowaki, Hiromasa Hasegawa, Shintaro Honda, Takanori Arimoto, Tetsuro Shishido, Takuya Miyamoto, Hideaki Kamata, Osamu Nakajima, Isao Kubota
  • Journal Title: Am Heart Assoc. Volume: 5 Pages: e002485
  • DOI: 10.1161/JAHA.115.002485.
• [Journal Article] Prolyl Isomerase Pin1 Negatively Regulates AMPK by Associating with the CBS Domain in the γ-subunit. (2015)
  • Author(s): Yusuke Nakatsu, Misaki Iwashita, Hideyuki Sakoda, Hiraku Ono, Kengo Nagata, Yasuka Matsunaga, Toshiaki Fukushima, Midori Fujishiro, Akifumi Kushiyama, Hideaki Kamata, Shin-Ichiro Takahashi, Hideki Katagiri,Hiroaki Honda, Hiroshi Kiyonari, Takafumi Uchida, and Tomoichiro Asano.
  • Journal Title: Ｊournal of Biological Chemistry Volume: 290 Pages: 24255-24266
  • DOI: 10.1074/jbc.M115.658559
• [Journal Article] LUBAC formation is impaired in the livers of mice with MCD-dependent non-alcoholic steatohepatitis (2015)
  • Author(s): Yasuka Matsunaga, Yusuke Nakatsu, Toshiaki Fukushima, Hirofumi Okubo, Misaki Iwashita, Hideyuki Sakoda, Midori Fujishiro, Takeshi Yamamotoya, Akifumi Kushiyama, Shin-Ichiro Takahashi, Yoshihiro Tsuchiya, Hideaki Kamata, Fuminori Tokunaga, Kazuhiro Iwai, and Tomoichiro Asano.
  • Journal Title: Mediators of inflammation Volume: 2015 Pages: 125380
  • DOI: 10.1155/2015/125380.
• [Journal Article] Pin1 inhibitor Juglone exerts anti-oncogenic effects on LNCaP and DU145 cells despite the patterns of gene regulation by Pin1 differing between these cell lines (2015)
  • Author(s): Ryuhei Kanaoka, Akifumi Kushiyama, Yasuyuki Seno, Yusuke Nakatsu, Yasuka Matsunaga, Toshiaki Fukushima, Yoshihiro Tsuchiya, Hideyuki Sakoda, Midori Fujishiro, Takeshi Yamamotoya, Hideaki Kamata, Akio Matsubara, and Tomoichiro Asano.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 10 Pages: e0127467
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0127467.
• [Journal Article] DPP-4 inhibitor anagliptin exerts anti-inflammatory effects on macrophages, adipocytes, and mouse livers by suppressing NF-κB activation (2015)
  • Author(s): Takanori Shinjo, Yusuke Nakatsu, Misaki Iwashita, Tomoni Sano, Hideyuki Sakoda, Hisamitsu Ishihara, Akifumi Kushiyama, Midori Fujishiro, Toshiaki Fukushima, Yoshihiro Tsuchiya, Hideaki Kamata, Fusanori Nishimura1, Tomoichiro Asano.
  • Journal Title: American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism Volume: 309 Pages: E214-23
  • DOI: 10.1152/ajpendo.00553.2014.
• [Journal Article] The xanthine oxidase inhibitor febuxostat suppresses development of nonalcoholic steatohepatitis in a rodent model (2015)
  • Author(s): Yusuke Nakatsu, Yasuyuki Seno, Akifumi Kushiyama, Hideyuki Sakoda, Midori Fujishiro, Aya Katasako, Keiichi Mori, Yasuka Matsunaga, Toshiaki Fukushima, Ryuhei Kanaoka, Takeshi Yamamotoya, Hideaki Kamata, Tomoichiro Asano
  • Journal Title: American Journal of Physiology - Gastrointestinal Liver Physiology Volume: 309 Pages: G42-51
  • DOI: 10.1152/ajpgi.00443.2014.
• [Journal Article] Nedd4-induced mono-ubiquitination of IRS-2 enhances IGF signaling and mitogenic activity. (2015)
  • Author(s): Toshiaki Fukushima, Hidehito Yoshihara, Haruka Furuta, Fumihiko Hakuno, Jing Luan, Cunming Duan, Yasushi Saeki, Keiji Tanaka, Shun-Ichiro Iemura, TohruNatsume, Kazuhiro Chida, Yusuke Nakatsu, Hideaki Kamata, Tomoichiro Asano, and Shin-Ichiro Takahashi
  • Journal Title: Nature communications Volume: 6 Pages: 6780
  • DOI: 10.1038/ncomms7780
• [Journal Article] Mosapride citrate improves nonalcoholic steatohepatitis with increased fecal lactic acid bacteria and plasma glucagon-like peptide-1 level in a rodent model. (2015)
  • Author(s): Hirofumi Okubo, Yusuke Nakatsu, Hideyuki Sakoda, Akifumi Kushiyama, Midori Fujishiro, Toshiaki Fukushima, Yasuka Matsunaga, Haruya Ohno, Masayasu Yoneda, Hideaki Kamata, Takanori Shinjo, Misaki Iwashita, Fusanori Nishimura, and Tomoichiro Asano
  • Journal Title: American Journal Physiolgy-Gastrointestinal and Liver Physiogy Volume: 308 Pages: 151-158
  • DOI: 10.1152/ajpgi.00198.2014.
• [Presentation] RelAの転写活性化ドメインを介したIKK活性制御機構 (2015)
  • Author(s): 土谷佳弘 樋口徹 松永泰花 高橋江奈 中津祐介 浅野知一郎 鎌田英明
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会 第87回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 非アルコール性肝炎におけるLUBAC形成障害の解析 (2015)
  • Author(s): 松永泰花 中津祐介 福嶋俊明 大久保博史 岩下未咲 迫田秀之 藤城緑 山本屋武 櫛山暁史 高橋伸一郎 土谷佳弘 鎌田英明 徳永文稔 岩井一宏 浅野知一郎
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会 第87回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 計画的細胞死にともなう細胞内レドックスと小胞輸送系の改変 (2015)
  • Author(s): 樋口徹 土谷佳弘 金本麻裕 高橋江奈 中津祐介 浅野知一郎 鎌田英明
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会 第87回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04