NADPHオキシダーゼ活性の時空間的定量法の確立

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Oxygen biology: a new criterion for integrated understanding of life
• Project/Area Number: 15H01398
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 吉岡 博文 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30240245)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 活性酸素 / リン酸化酵素

Outline of Annual Research Achievements

ベンサミアナタバコ (Nicotiana benthamiana) においては、NbRBOHBが病害応答性CDPKやRLCKによってリン酸化され、ROS生産を誘導する。本年度は、２種の蛍光タンパク質 (YFP、CFP)、NbRBOHB由来のリン酸化配列を用いて、CDPKまたはRLCKによるリン酸化によって生ずる構造の変化に伴って蛍光共鳴エネルギー移動 (Foster Resonance Energy Transfer: FRET) が起こる２つのセンサーの基本構造を構築し、FRET効率の最適化を図った。
FRETシステムは、センサーのリン酸化時と非リン酸化時で異なる波長の蛍光として観察されるため、CDPKまたはRLCKの活性化を生細胞で蛍光として観察できる。２遺伝子発現型バイナリーベクターをベースとして、作製したセンサーとエフェクターをそれぞれ35Sプロモーターの下流に挿入した。エフェクターには、病害応答性CDPKの恒常活性型変異体 (NbCDPK5VK) および非活性型変異体 (NbCDPK5VK-KM) を用いた。これらバイナリーベクターを、アグロインフィルタレーション法によってベンサミアナタバコに導入して発現させ、葉組織から粗抽出液を調製し、マルチプレートリーダーを用いてFRET蛍光 (YFP/CFP) の強度を評価した。しかし、現在までに良好なFRET蛍光は得られていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成27年度は、センサーの基本構造を構築し、FRET効率を最適化する目的で様々なコンストラクトを作製した。FRET強度比 (ON時/OFF時) が1.3以上であることが、実用レベルのセンサーの目安とされている。一過的発現系を用いてベンサミアナ葉でFRET強度比(NbCDPK5VK / NbCDPK5VK-KM)を測定した結果、これまでに基準値以上のセンサーが得られていない。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、センサーの構造を最適化する目的で、さらに多くのバリエーションを持たせたコンストラクトを作製し、FRET強度比が1.3以上であるセンサー構造を模索する。また、抗リン酸化抗体を用いた免疫ブロットによりセンサーのリン酸化を評価する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] LIPM(フランス)
  • Country Name: FRANCE
  • Counterpart Institution: LIPM
• [Journal Article] SGT1 contributes to maintaining protein levels of MEK2DD to facilitate hypersensitive response-like cell death in Nicotiana benthamiana. (2016)
  • Author(s): Ichimura, K., Shinzato, T., Edaki, M., Yoshioka, H. and Shirasu, K.
  • Journal Title: Physiological and Molecular Plant Pathology Volume: 94 Pages: 47-52
  • DOI: org/10.1016/j.pmpp.2016.04.001
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Hierarchical regulation of NADPH oxidase by protein kinases in plant immunity. (2016)
  • Author(s): Yoshioka, H., Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Asai, S. and Yoshioka, M.
  • Journal Title: Physiological and Molecular Plant Pathology Volume: 95 Pages: 20-26
  • DOI: org/10.1016/j.pmpp.2016.03.004
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Nicotiana benthamiana MAPK-WRKY pathway confers resistance to a necrotrophic pathogen Botrytis cinerea. (2016)
  • Author(s): Adachi, H., Ishihama, N., Nakano, T., Yoshioka, M. and Yoshioka, H. (2016) Nicotiana benthamiana MAPK-WRKY pathway confers resistance to a necrotrophic pathogen Botrytis cinerea.
  • Journal Title: Plant Signal. Behav. Volume: in press Pages: 未定
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A receptor pair with an integrated decoy converts pathogen disabling of transcription factors to immunity. (2015)
  • Author(s): Le Roux, C., Huet, G., Jauneau, A., Camborde, L., Tremousaygue, D., Kraut, A., Zhou, B., Levaillant, M., Adachi, H., Yoshioka, H., Raffaele, S., Berthome, R., Coute, Y., Parker, J.E. and Deslandes, L.
  • Journal Title: Cell Volume: 161 Pages: 1074-1088.
  • DOI: 10.1016/j.cell.2015.04.025.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cell death-inducing stresses are required for defense activation in DS1-phosphatidic acid phosphatase-silenced Nicotiana benthamiana. (2015)
  • Author(s): Nakano, M., Yoshioka, H., Ohnishi, K., Hikichi, Y. and Kiba, A.
  • Journal Title: J. Plant Physiol. Volume: 184 Pages: 15-19.
  • DOI: 10.1016/j.jplph.2015.06.007.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular characterization of LjABCG1, an ATP-binding cassette protein in Lotus japonicus. (2015)
  • Author(s): Sugiyama, A., Fukuda, S., Takanashi, K., Yoshioka, M., Yoshioka, H., Narusaka, Y., Narusaka, M., Kojima, M., Sakakibara, H., Shitan, N., Sato, S., Tabata, S., Kawaguchi, M. and Yazaki, K.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 10 Pages: e0139127
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0139127.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] WRKY transcription factors phosphorylated by MAPK regulate a plant immune NADPH oxidase in Nicotiana benthamiana. (2015)
  • Author(s): Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Yoshioka, M., Katou, Y., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
  • Journal Title: Plant Cell Volume: 27 Pages: 2645-2663.
  • DOI: 10.1105/tpc.15.00213.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] リン酸化反応が制御するROSバーストの分子機構． (2015)
  • Author(s): 吉岡博文・安達広明・石濱伸明・中野孝明・白石佑太郎・宮川典子・野村裕也・吉岡美樹・浅井秀太
  • Journal Title: 日本植物病理学会報 Volume: 81 Pages: 1-8.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Kinase-mediated orchestration of NADPH oxidase in plant immunity. (2015)
  • Author(s): Adachi, H. and Yoshioka, H.
  • Journal Title: Brief. Funct. Genomics Volume: 14 Pages: 253-259.
  • DOI: 10.1093/bfgp/elv004.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 植物免疫に関わるNADPH oxidaseの活性化機構 (2015)
  • Author(s): 吉岡博文
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートピアホテル
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
  • Invited
• [Presentation] Protein kinase-mediated regulation of NADPH oxidase in plant immunity. (2015)
  • Author(s): Yoshioka, H., Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Asai, S., Ishihama, N. and Yoshioka, M.
  • Organizer: 11th US-Japan Scientific Seminar
  • Place of Presentation: 香川
  • Year and Date: 2015-10-26 – 2015-10-29
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] MAPK-WRKY pathway up-regulates NbRBOHB gene and contributes to effector-triggered ROS burst in Nicotiana benthamiana. (2015)
  • Author(s): Adachi, H., Nakano, T., Miyagawa, N., Ishihama, N., Yoshioka, M., Katou, Y., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
  • Organizer: The 4th International Conference on Biotic Plant Interactions.
  • Place of Presentation: 中国
  • Year and Date: 2015-08-26 – 2015-08-29
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Transactivation of NbRBOHB gene via MAPK-WRKY pathway is essential for effector-triggered ROS burst in Nicotiana benthamiana. (2015)
  • Author(s): Adachi, H., Ishihama, N., Nakano, T., Miyagawa, N., Yoshioka, M., Yaeno, T., Shirasu, K. and Yoshioka, H.
  • Organizer: 12th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants: from model systems to field.
  • Place of Presentation: イタリア
  • Year and Date: 2015-05-24 – 2015-05-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] RLCK-mediated phosphorylation of the N-terminus of RBOH regulates ROS burst in rice. (2015)
  • Author(s): Yoshioka, M., Yamaguchi, K., Fujiwara, M., Yoshimura, S., Kawasaki, T. and Yoshioka, H.
  • Organizer: 12th International Conference on Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants: from model systems to field.
  • Place of Presentation: イタリア
  • Year and Date: 2015-05-24 – 2015-05-27
  • Int'l Joint Research
• [Remarks]
  • URL: http://www.agr.nagoya-u.ac.jp/~bio4283/index.html