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2015 Fiscal Year Annual Research Report

遺伝子コードされたFRET型酸素バイオセンサーの開発

Publicly Offered Research

Project AreaOxygen biology: a new criterion for integrated understanding of life
Project/Area Number 15H01401
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

今村 博臣  京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Keywordsバイオセンサー / イメージング / 酸素 / FRET
Outline of Annual Research Achievements

まず、酸素結合タンパク質であるFixLの大腸菌における発現条件を最適化した。複数の大腸菌株を使用したスクリーニングの結果、C41(DE3)株を用い37度で培養した際に、ヘムを有するFixLの割合が最も高くなることが明らかとなった。この際に鉄イオンを培地中に添加することで、ヘム含量が増加した。次に、大腸菌で発現させたFixLを精製し、吸収スペクトルの解析をおこなったところ、生成されたFixLは過酸化状態であった。還元剤およびグルコースオキシダーゼをもちいることで、過酸化状態を酸素結合状態および酸素非結合状態に変換する条件を確立した。
次に、酸素結合状態のFixLを特異的に認識する抗体のスクリーニングをファージディスプレイ法を用いておこなった。まず、FixLをプラスチックチューブ表面に固定した状態でスクリーニングをおこなったが、特異的な抗体を得ることができなかった。プラスチック表面に固定されたFixLが変性したためと考えられた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

第一に、購入した抗体スクリーニングキットの一部に不良があり、その問題の解決に大きな時間がかかってしまった。次に、常法として用いられているプラスチックチューブにタンパク質を固定化する方法では、目的とする抗体を得られなかった。

Strategy for Future Research Activity

FixLタンパク質を固定化する方法として、プラスチックチューブの代わりに磁気ビーズなどを用いたより温和な条件を用い、再度抗体のスクリーニングをおこなう。ここでも抗体が得られない場合は、市販のライブラリーではなく、FixLで免疫したマウスよりファージディスプレイライブラリーを作製して実験を進める。酸素結合状態のFixLを特異的に認識する抗体クローンを得た後、抗体・FixL・蛍光タンパク質を融合させた酸素バイオセンサーを構築する。構築したバイオセンサーを哺乳類細胞に発現させ、酸素濃度を増減させた際に、蛍光シグナルが変化するものをスクリーニングする。

  • Research Products

    (16 results)

All 2016 2015

All Journal Article (5 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 2 results) Presentation (11 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Visualization of NO3-/NO2- dynamics in living cells by fluorescence resonance energy transfer (FRET) imaging employing a Rhizobial two-component regulatory system2016

    • Author(s)
      Hidaka M, Gotoh A, Shimizu T, Minamisawa K, Imamura H, Uchida T
    • Journal Title

      J. Biol. Chem.

      Volume: 291 Pages: 2260-2269

    • DOI

      10.1074/jbc.M115.687632

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Glycolysis, but not mitochondria, responsible for intracellular ATP distribution in cortical area of podocytes2015

    • Author(s)
      Ozawa S, Ueda S, Imamura H, Mori K, Asanuma K, Yanagita M, Nakagawa T
    • Journal Title

      Sci. Rep.

      Volume: 5 Pages: 18575

    • DOI

      10.1038/srep18575

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Mild glucose starvation induces KDM2A-mediated H3K36me2 demethylation through AMPK to reduce rRNA transcription and cell proliferation2015

    • Author(s)
      Tanaka Y, Yano H, Ogasawara S, Yoshioka SI, Imamura H, Okamoto K, Tsuneoka M
    • Journal Title

      Mol. Biol. Cell.

      Volume: 35 Pages: 4170-4184

    • DOI

      10.1128/MCB.00579-15

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Associative interactions in crowded solutions of biopolymers counteract depletion effects2015

    • Author(s)
      Groen J, Foschepoth D, Te Brinke E, Boersma AJ, Imamura H, Rivas G, Heus HA, Huck WT
    • Journal Title

      J. Am. Chem. Soc

      Volume: 137 Pages: 13041-13048

    • DOI

      10.1021/jacs.5b07898

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] The plasma membrane calcium pump in pancreatic cancer cells exhibiting the Warburg effect relies on glycolytic ATP2015

    • Author(s)
      James AD, Patel W, Butt Z, Adiamah M, Dakhel R, Latif A, Uggenti C, Swanton E, Imamura H, Siriwardena AK, Bruce JI
    • Journal Title

      J. Bio. Chem.

      Volume: 290 Pages: 24760-24771

    • DOI

      10.1074/jbc.M115.668707

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 細胞外ATPの定量的蛍光イメージングを目指したバイオセンサーの開発2015

    • Author(s)
      西山翠、岩切竜太、垣塚彰、今村博臣
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-03
  • [Presentation] 腎臓糸球体構成細胞ポドサイト細胞における、ATP産生に着目した解糖系とミトコンドリアの異なる役割2015

    • Author(s)
      小沢将太、上田修子、今村博臣、森潔、浅沼克彦、柳田素子、仲川孝彦
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-03
  • [Presentation] ミトコンドリアA3243G変異患者から樹立した疾患特異的iPS細胞の機能解析2015

    • Author(s)
      松原正樹、神田一、今村博臣、井上真由美、野口倫夫、細田公則、垣塚彰、中尾一和
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-03
  • [Presentation] 生細胞内ATP濃度のダイナミクス・分布・多様性2015

    • Author(s)
      今村博臣
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-01
    • Invited
  • [Presentation] ホスファチジルセリンに対するFRET型蛍光バイオセンサーの開発2015

    • Author(s)
      西谷勇人、今村博臣、垣塚彰
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-01
  • [Presentation] パーキンソン病モデルにおけるATP制御による予防法の確立2015

    • Author(s)
      中野将希、首藤敏之、今村博臣、垣塚彰
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-01
  • [Presentation] 麻酔効果と細胞内ATPレベルの関連性2015

    • Author(s)
      井上勇奎、岸川淳一、中西温子、船越勇殻、西村健司、藤川誠、今村博臣、横山謙
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-01
  • [Presentation] ATP metabolism in Xenopus laevis: Is ATP yielded by glycolysis during maturation?2015

    • Author(s)
      井尻貴之、岸川淳一、今村博臣、峰家真穂、上野秀一、岩尾康宏、横山謙、佐藤賢一
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
    • Place of Presentation
      神戸ポートアイランド
    • Year and Date
      2015-12-01
  • [Presentation] パーキンソン病モデルにおけるATP制御による予防法の確立に向けて2015

    • Author(s)
      中野将希、首藤敏之、今村博臣、垣塚彰
    • Organizer
      第15回日本ミトコンドリア学会年会
    • Place of Presentation
      福井県国際交流会館
    • Year and Date
      2015-11-20
  • [Presentation] Improvement of binding speed and photostability of fluorescent ATP biosensor for extracellular ATP imaging2015

    • Author(s)
      Imamura H, Nishiyama S, Iwakiri R, Kakizuka A
    • Organizer
      第53回日本生物物理学会年会
    • Place of Presentation
      金沢大学
    • Year and Date
      2015-09-14
  • [Presentation] Development of a new BRET based ATP indicator for high-throughput quantitative ATP assay2015

    • Author(s)
      Yoshida T, Imamura H
    • Organizer
      第53回日本生物物理学会年会
    • Place of Presentation
      金沢大学
    • Year and Date
      2015-09-13

URL: 

Published: 2017-01-06  

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