2015 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子コードされたFRET型酸素バイオセンサーの開発
Publicly Offered Research
| Project Area | Oxygen biology: a new criterion for integrated understanding of life |
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| Project/Area Number |
15H01401
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
今村 博臣 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20422545)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオセンサー / イメージング / 酸素 / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず、酸素結合タンパク質であるFixLの大腸菌における発現条件を最適化した。複数の大腸菌株を使用したスクリーニングの結果、C41(DE3)株を用い３７度で培養した際に、ヘムを有するFixLの割合が最も高くなることが明らかとなった。この際に鉄イオンを培地中に添加することで、ヘム含量が増加した。次に、大腸菌で発現させたFixLを精製し、吸収スペクトルの解析をおこなったところ、生成されたFixLは過酸化状態であった。還元剤およびグルコースオキシダーゼをもちいることで、過酸化状態を酸素結合状態および酸素非結合状態に変換する条件を確立した。
次に、酸素結合状態のFixLを特異的に認識する抗体のスクリーニングをファージディスプレイ法を用いておこなった。まず、FixLをプラスチックチューブ表面に固定した状態でスクリーニングをおこなったが、特異的な抗体を得ることができなかった。プラスチック表面に固定されたFixLが変性したためと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
第一に、購入した抗体スクリーニングキットの一部に不良があり、その問題の解決に大きな時間がかかってしまった。次に、常法として用いられているプラスチックチューブにタンパク質を固定化する方法では、目的とする抗体を得られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
FixLタンパク質を固定化する方法として、プラスチックチューブの代わりに磁気ビーズなどを用いたより温和な条件を用い、再度抗体のスクリーニングをおこなう。ここでも抗体が得られない場合は、市販のライブラリーではなく、FixLで免疫したマウスよりファージディスプレイライブラリーを作製して実験を進める。酸素結合状態のFixLを特異的に認識する抗体クローンを得た後、抗体・FixL・蛍光タンパク質を融合させた酸素バイオセンサーを構築する。構築したバイオセンサーを哺乳類細胞に発現させ、酸素濃度を増減させた際に、蛍光シグナルが変化するものをスクリーニングする。
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[Journal Article] The plasma membrane calcium pump in pancreatic cancer cells exhibiting the Warburg effect relies on glycolytic ATP2015
Author(s)
James AD, Patel W, Butt Z, Adiamah M, Dakhel R, Latif A, Uggenti C, Swanton E, Imamura H, Siriwardena AK, Bruce JI
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Journal Title
J. Bio. Chem.
Volume: 290
Pages: 24760-24771
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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