新生膜タンパク質の膜組込み過程の構造生物科学

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 15H01537
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 田中 良樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (10632333)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: タンパク質 / YidC / Sec / 膜タンパク質 / タンパク質輸送 / 膜組み込み / X線結晶構造解析 / 構造生物学

Outline of Annual Research Achievements

本研究では生育に必須の「新生膜タンパク質の膜組込み過程」に注目して，構造機能解析を行っていく．タンパク質膜組み込み過程には，Sec経路とYidC経路が存在する．どちらの経路においても，タンパク質の認識機構や組み込みに関わるタンパク質の動きに関しての詳細は解明されていない．平成27年度には，Sec経路を構成する輸送体膜タンパク質の構造解析を行い，SecYEG複合体完全長を含む構造について論文にまとめ発表した．構造解析対象のタンパク質は既に立体構造を決定したものであるが，以前とは結晶化における条件を変化させることで分解能の向上および別形態構造決定に至った．得られた新規の構造情報を用いて，分子動力学シミュレーションや変異体解析を現在進行中である．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Sec経路を構成する輸送体膜タンパク質について結晶構造解析を中心とした機能解析を進めている．SecYEG（細菌型Secトランスロコン）の高分解能(2.7オングストローム分解能)の構造を決定。この構造情報に基づき機能解析し，タンパク質膜透過しない（閉状態）のチャネル（透過孔）が、複合体を形成する膜たんぱく質（SecG）の一部によって「キャップ（蓋）」がされていることを明らかにした。引き続き，シグナル配列との複合体での解析のため，複数の結合候補ペプチドを合成し，混同状態での結晶化を行っている．しかし，これまでのところシグナル配列を含む構造は得られていない．一方，新たに立体構造を決定したSecタンパク質に関して，分解能向上や他状態の構造決定のために，以前とは結晶化における条件を変化させて結晶化，構造決定を行った．得られた新規の構造情報を用いて，分子動力学シミュレーションや変異体解析を現在進行中である．

Strategy for Future Research Activity

研究成果を論文にまとめ発表するため，構造情報に基づく各種機能解析を進めていく．ペプチドの認識状態を結晶構造で明らかにするために，共結晶化が必要である．これまでに試したアミノ酸配列では結合が弱いと考えられるため，配列の再検討やスペーサーを介して融合タンパク質として発現させる等して，より結合状態が安定する方法を試みる．
YidC シグナル配列の構造解析：YidC については申請者らのグループが2 種類のYidC の構造決定を行った ．SecYEG 複合体と同様に， YidC がどのように膜組込み基質タンパク質を認識して機能しているのかについての詳細は未だ不明な点が多い。相互作用の詳細を明らかとすべく基質タンパク質との共結晶化を試みる。基質タンパク質には， YidC の基質と判明しているシグナル領域を用いる。YidC は基質の膜貫通領域付近の負電荷を認識していることが提案されているため，負電荷が存在する膜貫通領域付近の配列をもったポリペプチドとの共結晶化をLCP 法によって進める。X線回折データの収集は，SPring-8 BL32XUの高輝度X線マイクロフォーカスビームラインを用いる．位相の決定は，まず分子置換法を試みるが，構造が大きく変化し，分子置換法で位相の決定が困難な場合は，以前の研究同様に重原子置換体を用いた異常分散法を用いて構造を決定する。
YidC再構成Nanodiscを用いた機能解析：基質認識についての構造情報が得られた場合，基質のどこを認識して，基質膜タンパク質を組込んでいるのかの情報を得る。この解析手法が機能すれば，続いてSecYEG 複合体を用いて多数の膜貫通領域をもっタンパク質の膜組込み解析への応用を進める。

Research Products

• [Journal Article] Crystal Structures of SecYEG in Lipidic Cubic Phase Elucidate a Precise Resting and a Peptide-Bound State. (2015)
  • Author(s): Tanaka Y, Sugano Y, Takemoto M, Mori T, Furukawa A, Kusakizako T, Kumazaki K, Kashima A, Ishitani R, Sugita Y, Nureki O and Tsukazaki T
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 13 Pages: 1561–1568
  • DOI: 10.1016
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Complete and peptide-bound structures of the Sec translocon (2015)
  • Author(s): Yoshiki Tanaka, Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: 新学術領域研究「動的秩序と機能」第4回公開国際シンポジウム
  • Place of Presentation: 九州大学西新プラザ（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-23
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 新生膜タンパク質の膜組込み過程の構造生物科学 (2015)
  • Author(s): 田中 良樹
  • Organizer: 新学術領域研究「新生鎖の生物学」 平成27年度第2回班会議
  • Place of Presentation: ほほえみの宿（山形県天童市）
  • Year and Date: 2015-11-13 – 2015-11-15
• [Presentation] タンパク質分泌マシーナリーの動的精密探査に向けて (2015)
  • Author(s): 菅野 泰功, 田中 良樹, 武本 瑞貴, 森 貴治, 春山 隆充, 古川 新, 草木迫 司, 熊崎 薫, 鹿島 絢子, 石谷 隆一郎, 紺野 宏記, 杉田 有治, 濡木 理, 塚﨑 智也
  • Organizer: 新学術領域研究「新生鎖の生物学」 平成27年度第2回班会議
  • Place of Presentation: ほほえみの宿（山形県天童市）
  • Year and Date: 2015-11-13 – 2015-11-15
• [Presentation] Secトランスロコンの相互作用解析 (2015)
  • Author(s): 古川新, 田中 良樹
  • Organizer: 新学術領域研究「新生鎖の生物学」 平成27年度第2回班会議
  • Place of Presentation: ほほえみの宿（山形県天童市）
  • Year and Date: 2015-11-13 – 2015-11-15
• [Presentation] Structures of Membrane Protein Insertase YidC (2015)
  • Author(s): Tomoya Tsukazaki, Kaoru Kumazaki, Shinobu Chiba, Mizuki Takemoto, Arata Furukawa, Toshiki Kishimoto, Yasunori Sugano, Takaharu Mori, Yoshiki Tanaka, Yuji Sugita, Koreaki Ito, Ryuichiro Ishitani and Osamu Nureki
  • Organizer: Structural Biological Dynamics: From Molecules to Life with 60 trillion Cells
  • Place of Presentation: 東京大学 伊藤国際学術研究センター（東京都文京区）
  • Year and Date: 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cytoplasmic conformational transition of Sec translocon (2015)
  • Author(s): Yoshiki Tanaka, Yasunori Sugano, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Takamitsu Haruyama, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Kaoru Kumazaki, Ayako Kashima, Ryuichiro Ishitani, Hiroki Konno, Yuji Sugita, Osamu Nureki and Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: 第53回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-13 – 2015-09-15
• [Presentation] Structure and dynamics of Sec protein-conducting channel (2015)
  • Author(s): Yasunori Sugano, Yoshiki Tanaka*, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Takamitsu Haruyama, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Kaoru Kumazaki, Ayako Kashima, Ryuichiro Ishitani, Hiroki Konno, Yuji Sugita, Osamu Nureki and Tomoya Tsukazaki
  • Organizer: 第53回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-13 – 2015-09-15
• [Presentation] Sec トランスロコンの高分解構造 (2015)
  • Author(s): 塚﨑 智也, 田中 良樹, 紺野 宏紀
  • Organizer: 新学術領域「動的秩序と機能」全体班会議2015
  • Place of Presentation: 兵庫県立淡路夢舞台国際会議場（兵庫県淡路市）
  • Year and Date: 2015-08-05
• [Presentation] 新生膜タンパク質の膜組込み過程の構造生物科学 (2015)
  • Author(s): 田中 良樹
  • Organizer: 新学術領域研究「新生鎖の生物学」 平成27年度第1回班会議
  • Place of Presentation: 東京工業大学キャンパスイノベーションセンター（東京都港区）
  • Year and Date: 2015-06-13
• [Presentation] タンパク質分泌マシーナリーの動的精密探査に向けて (2015)
  • Author(s): 菅野 泰功, 春山 隆充, 田中 良樹, 紺野 宏記, 塚﨑 智也
  • Organizer: 第12回21世紀大腸菌研究会
  • Place of Presentation: 琵琶湖グランド ホテル・京近江（滋賀県大津市）
  • Year and Date: 2015-06-04
• [Presentation] 部位特異的光架橋による YidC-Sec 複合体の 4 次構造決定にむけて (2015)
  • Author(s): 古川 新, 田中 良樹, 塚﨑 智也
  • Organizer: 第12回21世紀大腸菌研究会
  • Place of Presentation: 琵琶湖グランド ホテル・京近江（滋賀県大津市）
  • Year and Date: 2015-06-04
• [Presentation] Sec タンパク質膜透過装置の活写にむけて (2015)
  • Author(s): 塚﨑 智也, 田中 良樹
  • Organizer: 新学術領域「動的構造生命」第１回班会議
  • Place of Presentation: 九州大学（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2015-06-02
• [Remarks] 細胞膜を越えるたんぱく質輸送の新たな機構を解明
  • URL: http://www.naist.jp/pressrelease/detail_j/topics/2162/