2015 Fiscal Year Annual Research Report
蛋白質ダイナミクスのin-cell NMR解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
15H01636
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
杤尾 豪人 京都大学, 理学研究科, 教授 (70336593)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | NMR / ジスルフィド結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白質中のジスルフィド(SS)結合の安定性（酸化還元電位）は、SS結合の溶媒露出度に加えてシステイン残基周囲の構造揺らぎに依存する。また、環境の還元電位やpHに依存するため、細胞内の状態によってダイナミックに変動する。一般に、細胞内の還元電位はグルタチオンの濃度で決まるとされるが、活性酸素種の影響も受ける。加えて、細胞内環境自体が蛋白質の構造や揺らぎに影響を及ぼすことから、細胞内におけるSS結合の状態は試験管内の知見から簡単には予測できない。本課題では、NMRを使ってこの細胞内SS結合の安定性を評価する方法の構築を目指した。モデルとして、Csk(C-terminal Src kinase)のSH2ドメインを用いた。CskはSH2ドメイン中にジスルフィド(SS)結合を有するが、これが還元的に切断されるとCskのキナーゼ活性が10倍ほど上昇する事が知られている。細胞質は還元的ではあるものの、グルタチオン濃度が0.5～10mM程度である。一方、Csk SH2のSSは、50 mM DTTという極めて強い還元条件下でも、半分程度しか還元されないため、細胞中でCsk SH2のSSは切断されずに残ると予想される。
本年度は、まず、大腸菌を用いた15N標識SH2の発現と精製を行った。引き続き、その細胞内導入条件の検討を行った。細胞へのタンパク質導入は電気穿孔法を用いることとし、その電気パルスの条件（パルス長、印加電圧、回数など）を変えて、導入されるタンパク質の量を評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
電気パルスの条件（パルス長、印加電圧、回数など）を変えて、導入されるタンパク質の量を評価したが、高感度にNMR測定を行うためには導入量が十分ではないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き電気パルスの条件を検討する。また、細胞の培養条件や株を変更することで、タンパク質の導入効率を向上させることを検討する。さらには、NMR測定に供する細胞の数を増やすことで良好なNMR信号を得ることを目指す。
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