2015 Fiscal Year Annual Research Report
べん毛蛋白質輸送システムの動的機能構造解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
15H01640
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
南野 徹 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20402993)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 細菌 / 分子モーター / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、in vivoでの動態機能解析、X線結晶構造解析およびクライオ電子線トモグラフィー法による構造解析、さらにin vitroでの生化学的機能解析法を上手く組み合わせることで、フック完成シグナルに伴う輸送装置の基質認識モード切り替え機構を原子レベルで解明することを目的としている。本年度の主な成果は以下に示す。
1. FliH-FliI ATPase複合体のX線結晶構造解析に成功。さらに、結晶構造をベースにした機能解析により、FliHとFliIの相互作用に直接関わる重要な残基を同定。 2. 反転膜ベシクルを用いたin vitro輸送アッセイ系の構築に成功。さらに、ベシクル内に55 nmの長さのフックを作ることに成功。 3. 分子物差しとして機能するFliKのN末領域に光感受性のフェニルアラニン誘導体であるp-benzoyl-phenylalanine (pBPA) をFliKのN末端近傍領域（FliKN）に導入することに成功。さらに、UV光の照射によってFliKNがフックキャップ蛋白質FlgDおよびフック蛋白質FlgEと特異的に光架橋物を形成することを確認。
4. 高速AFMによりFlhAのC末細胞質ドメイン（FlhAC）が9量体リングを形成することが判明。
5. FlhACとFliH-FliI複合体の動的な相互作用により、べん毛構成蛋白質の輸送の順番が巧みに制御されることが判明。
6. FliKがFlhBCとμMオーダーで結合することを確認。さらに、FlhBCがFlhACとμMオーダーで、FliIとはnMオーダーで結合することも確認。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高速AFMによりFlhACの開閉運動および9量体リング形成過程を可視化することに成功。さらに反転膜ベシクルを用いてベシクル内に55 nmのフックを作ることに成功した。しかしながら、フックシグナリング複合体の結晶は未だ得られていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
光感受性のフェニルアラニン誘導体であるp-benzoyl-phenylalanine を導入したFliKCがUV光の照射によってFlhBCおよびFlhACと光架橋物が形成されるかどうかを調べる。FlgDおよびFlgEと特異的に光架橋物を形成できたFliKをin vitro輸送アッセイ系に使用することで、フック構築中にFliKがフックキャップやフックと相互作用することで分子物差しとして機能しているかどうかを確認する。
高速AFMによるFlhACの動的構造解析と遺伝学的機能解析法をうまく組み合わせることで、FlhACリング形成と輸送装置の選択物質輸送の関連性を詳細に解析する。
FlhACとフックシグナリング複合体のコンポーネントとの複合体の精製及び結晶化を行う。
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[Journal Article] FliH and FliI ensure efficient energy coupling of flagellar type III protein export in Salmonella.2016
Author(s)
Minamino, T., Kinoshita, M., Inoue, Y., Morimoto, Y.V., Ihara, K., Koya, S., Hara, N., Nishioka, N., Kojima, S., Homma, M. & Namba, K.
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Journal Title
MicrobiologyOpen
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Weak interactions between Salmonella enterica FlhB and other flagellar export apparatus proteins govern type III secretion dynamics2015
Author(s)
McMurry, J.L., Minamino, T., Furukawa, Y., Francis, J.W., Hill, S.A., Helms, K.A., Namba, K.
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Journal Title
PLOS One
Volume: 10
Pages: e0134884
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Molecular basis for dynamic structural properties of the C ring in the bacterial flagellar motor.2016
Author(s)
Kihoshita, M., Furukawa, Y., Imada, K., Namba, K., Minamino, T.
Organizer
GRC on Sensory Transduction in Microorganisms
Place of Presentation
Ventura Beach Marriott, California, USA
Year and Date
2016-01-17 – 2016-01-22
Int'l Joint Research
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[Presentation] バクテリアFlgNシャペロンの機能構造スイッチの分子基盤. Molecular basis for a structural switch of FlgN that regulates its chaperone activity.2015
Author(s)
Kinoshita, M., Nakanishi, Y., Furukawa, Y., Imada, K., Namba, K., Minamino, T.
Organizer
第53回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
金沢大学（石川県金沢市）
Year and Date
2015-09-15
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[Presentation] Structural characterization of FliP, a component of flagellar type III protein export apparatus.2015
Author(s)
Fukumura, T., Makino, F., Kato, T., Imada, K., Namba, K., Minamino, T.
Organizer
第53回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
金沢大学（石川県金沢市）
Year and Date
2015-09-14
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[Presentation] 細菌べん毛III型分泌装置のエネルギー変換メカニズム. An energy transduction mechanism of the bacterial flagellar type III secretion apparatus.2015
Author(s)
Terashima, H., Kawamoto, A., Tatsumi, C., Minamino, T., Namba, K., Imada, K.
Organizer
第53回日本生物物理学会年会
Place of Presentation
金沢大学（石川県金沢市）
Year and Date
2015-09-13
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