2015 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質ポリマー形成による動的膜形態形成の直接可視化による解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
15H01641
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
末次 志郎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (70345031)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 生物物理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
試験管内のBARドメインタンパク質による脂質膜チューブ形成の開始と伸長過程の可視化
endophilinについては、安藤班と共同で、原子間力顕微鏡によりチューブ形成の可視化に成功した。しかし、チューブ形成は非常に短時間で生じることがわかった。この急速なチューブ形成のため、原子間力顕微鏡の走査速度では、脂質膜表面のタンパク質の粒子は観察できず、従って、チューブ形成の過程の可視化には成功していない。そこで、チューブ形成を緩やかに生じさせるために、脂質膜の組成を検討した。endophilinと様々な組成の再構成膜を反応させ、再構成膜の形態を負染色により電子顕微鏡で観察した。その結果、脂質膜の脂肪酸の飽和度や電荷を持ったホスファチジルセリンの含量によってチューブ形成能が変化することを見出した。
細胞内のBARドメインタンパク質による脂質膜チューブ形成の開始過程の可視化
BARドメインタンパク質を培養細胞において観察するために、GFP融合タンパク質の安定発現株の樹立を試み、またレトロウイルスによる安定発現を行った。次にGFPの一分子局在を解析するために、GFPに対する組み換え抗体（nanobody）を用いた。Nanobodyは分子量が通常の抗体よりも小さいために、浸透がよく、GFPの標識密度を上げることが可能であると考えられる。GFPに対するnanobodyをAlexa647で標識し、超解像観察を行った結果、分子局在を細胞内で検出することに成功した。その際近接距離は、タンパク質分子の大きさと近く、BARドメインタンパク質の膜上での整列が示唆された。BARドメインを直接ラベルする抗体については適切な抗体を見出せなかったため引き続き抗体を検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
すでに目的としているBARドメインタンパク質の一定の可視化に成功しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
ホスホイノシタイドの集積が、BARタンパク質のよる脂質膜チューブ形成のきっかけとなる可能性が考えられるので、ホスホイノシタイドを添加して作製したリポソームを用いて膜チューブ形成を観察する。ホスホイノシタイドの位置は、特異的に結合するPHドメインなどを用いて可視化することを検討する。また、超解像解析をさらに推し進め、細胞内における分子数に対する観察分子数を推定することで、多量体形成を結論づける。さらに、構造解析により同定したコンタクトサイトのアミノ酸残基に変異をいれ、変異体タンパク質を発現精製して、試験管内での脂質膜の形態形成における影響を調べる。また、細胞における膜構造形成における役割も、変異体を発現させることにより調べる。
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