インプリント遺伝子のDNAメチル化模様を制御するDnmt3aの過渡的複合体

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work
• Project/Area Number: 15H01653
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 古川 亜矢子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任助教 (90453050)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: DNAメチル化 / 酵素反応

Outline of Annual Research Achievements

ゲノムインプリンティングは、由来した親の性別によって対立遺伝子のどちらが発現するかが決定される機構である。この機構は、個体発生、成長などの過程で必須な役割を果たす。インプリント遺伝子発現の調節を行うのは、精子あるいは卵子において形成されるDNA のメチル化状態である。生化学的な実験から、インプリント遺伝子領域の時間経過と共に変化するメチル化状態は観測されているが、詳細なDnmt3aによるメチル化の順序や反応性は解析されていない。また、Dnmt3aはヌクレオソームが存在すると酵素活性が増加することも報告されている。そこで、CpGに富む配列のDNAに対するDnmt3aのメチル化反応を解析する。まずは、NMRを用いたメチル化反応を追跡する手法を確立するために、Dnmt3aと同じCpG配列をメチル化する大腸菌のメチル化酵素M.SssIを用いて実験を行った。標的DNAをNMR試料管内に入れた後に、メチル基供与体のSAMとメチル化酵素Dnmt3aを添加してメチル化反応を開始させ、シトシン5位に付加されるメチル基のNMRシグナルの増加をNOESY測定を用いて追跡した。しかしながら、感度や分解能に問題があったため、供与されるメチル基を13C標識したSAMを使用することにした。13C-SAMを用いることにより、付加されたメチル基だけを追跡することができ、長鎖DNAでも検出可能であった。過剰量のSAMや反応に必要なBuffer由来の塩などで検出感度が低下するため、測定方法の検討も行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

13C-SAMの合成に時間がかかったことと、ヌクレオソームの調製に時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

リアルタイムNMR法によるDnmt3aのヌクレオソームを含むDNAへのメチル化反応解析を行う。
207bpの601配列のヌクレオソームを調整し、リンカーに存在するCpG配列のメチル化反応を追跡する。ヌクレオソームが形成されている部位は、緩和が早くてシグナルが見えないと考えられるため、リンカー部分に入るメチル基は検出可能であると考える。調製したヌクレオソームにDnmt3aを添加し、どの位置のシトシンがメチル化されるかを解析する。以上の結果から、Dnmt3aのヌクレオソーム存在下でのDNAメチル化機構を明らかにする。