2016 Fiscal Year Annual Research Report
ヘムトランスポーターの動的結晶構造解析
Publicly Offered Research
| Project Area | Novel measurement techniques for visualizing 'live' protein molecules at work |
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| Project/Area Number |
15H01655
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
杉本 宏 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 専任研究員 (90344043)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヘム / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初の計画通り、溶液および結晶での時間分解測定に必要な技術開発を進めた。その装置の性能を示すために、モデル系としてヘムタンパク質の結晶内での反応について時間分解吸収スペクトル測定を行った。ケージドNO試薬を「タンパク質結晶」に浸潤し、励起用紫外レーザー照射で遊離させたNOが結晶内のヘム鉄に結合する過程のスペクトル変化を時間分解測定した。この結果を踏まえて、SACLA施設での予備的な実験も行い、反応を開始して20ミリ秒後には基質が活性部位へ結合していることを電子密度で確認した。生化学実験の手法として、リポソーム再構成系を用いてヘムトランスポーターの輸送活性の測定方法を開発した。従来のピリジン法やルミノール法によるヘムの定量法では、ヘムの疎水性が高いためにリポソームへの吸着が影響して正確な測定は不可能だった。そこで、ヘムを受け渡すペリプラズムヘム結合タンパク質にGFPを融合したものを測定系に利用した。ヘムがトランスポーター側へ移動することによって蛍光強度が増大することを見出し、高感度でヘムの輸送を定量することが可能になった。この手法を用いて変異体の活性の評価を行った結果、分子内に見出された大きなヘム輸送チャネルの表面の残基には効率的な輸送を可能にするユニークな動的性質があることが明らかとなった。この結果は、構造解析の成果と合わせて学術誌に掲載された。また、A03計画班と連携し、生体膜内でのヘムトランスポーターの全原子分子動力学計算を行うための初期パラメータ等の準備に着手し、MDシミュレーションを行った。この結果を基に、今後ターゲットMDや反応パス解析へ展開する計画である。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Crystal structure of bacterial haem importer complex in the inward-facing conformation2016
Author(s)
Naoe, Y., Nakamura, N., Doi, A., Sawabe, M., Nakamura, H., Shiro, Y., Sugimoto, H.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 7
Pages: 13411
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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