2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidating structural basis for the protein complex controlling photoperiod-dependent flowering pathway
Publicly Offered Research
| Project Area | Determining the principles of the birth of new plant species: molecular elucidation of the lock-and-key systems in sexual reproduction |
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| Project/Area Number |
19H04855
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
宮川 拓也 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (50596559)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 植物 / 花成誘導 / 光周期応答 / 蛋白質間相互作用 / 複合体構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
光周期依存経路は、日長という環境要因を植物が感知することで花成が促進される外因的経路であり、植物の開花時期を決定する重要な発生制御機構の一つである。この経路の中心的な転写因子であるCONSTANS（CO）は、光応答性のE3ユビキチンリガーゼにより転写と翻訳後修飾の二段階で調節されている。本研究では、光周期依存経路の制御タンパク質複合体を生化学・構造生物学的アプローチにより解析することで、CO及びその転写抑制因子CDF1の分解を導くE3ユビキチンリガーゼの光依存的な機能変換機構を理解することを目的としている。本研究で対象とする光周期依存経路の制御タンパク質複合体の構成因子は複数のドメインを有するが、どの領域で複合体が形成されるかは十分に理解されていない。そこで、各タンパク質が複合体を形成するために必要な領域を明らかにするため、全長及びドメイン構成に基づいた各種コンストラクトの調製を検討し、コムギ胚芽無細胞合成系での合成を確認した。さらにCO、CDF1、及びそれらの分解調節を担うE3ユビキチンリガーゼの機能ドメインに関して、大腸菌発現系を用いた調製条件を確立した。その他のコンストラクトについては、昆虫細胞-バキュロウイルス系での発現を並行して検討している。
また、葯・花粉の発達に関わる遺伝子等の転写調節に機能するブラシノステロイド（BR）に注目し、BRシグナル伝達のマスター転写因子であるBZR転写因子のDNA配列特異性とその構造基盤の解明にも取り組んだ。DAP-seqデータベース解析とそれに基づくDNA結合親和性の系統的解析により、BZR転写因子のG-box配列に対する親和性がその周辺の塩基配列の組み合わせで大きく異なることが示された。G-box配列を含み親和性の異なる複数のDNA断片とBZR転写因子の複合体構造を解析し比較した結果、BZR転写因子のDNA配列特異性を規定する新たな構造基盤が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
BZR転写因子のDNA配列特異性の構造基盤解析については当初計画通りの進捗が得られている。また、光周期依存経路の制御タンパク質複合体の解析については、コムギ胚芽無細胞合成系を用いて複合体の各構成因子の合成が確認でき、in vitro相互作用アッセイの検討が進んでいる。さらに一部の構成因子については構造解析に資するタンパク質調製条件の確立に至っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
構造解析に向けた複合体構成因子のタンパク質生産では昆虫細胞-バキュロウイルス系を用いた検討を引き続き行う。また、コムギ胚芽無細胞合成系ではほぼ全ての構成因子の合成が確認できたため、この合成系をスケールアップして生産したタンパク質を用いてAlphaScreen等のin vitro相互作用アッセイ法により相互作用領域の解析を進め、その結果に基づいて再構成した複合体の構造解析を目指す。
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