無細胞蛋白質アレイによるポリユビキチン鎖依存シグナル伝達経路の網羅的同定と解析

• 研究領域: 翻訳後修飾によるシグナル伝達制御の分子基盤と疾患発症におけるその破綻
• 研究課題/領域番号: 25117719
• 研究種目: 新学術領域研究(研究領域提案型)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 生物系
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2014年度)
• 配分額: 10,660千円 (直接経費: 8,200千円、間接経費: 2,460千円); 2014年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円); 2013年度: 5,330千円 (直接経費: 4,100千円、間接経費: 1,230千円)
• キーワード: ユビキチン / 無脂肪タンパク質合成 / ポリユビキチン鎖 / プロテインアレイ / コムギ胚芽 / シグナル伝達

研究実績の概要

III.ポリユビキチン鎖相互作用シグナル伝達関連タンパク質の生化学的解析 ：本年度は、直鎖状ポリユビキチン鎖と相互作用するCYLDタンパク質に関与すE3リガーゼ（CYLD-E3リガーゼ）を中心に解析を進めた。その結果、in vitroでCYLD-E3リガーゼはCYLDと結合しK48型のポリユビキチン化することが分かった。

IV.LUBAC系による直鎖状ポリユビキチン鎖依存活性化キナーゼおよびE3リガーゼの細胞内解析 ：連携研究者の徳永先生により分与されたHOIPおよびHOIL(HOIP-HOIL)を細胞に導入する事で、直鎖ポリユビキ チン鎖を細胞内に形成させる事ができる。１）細胞内解析：培養細胞にHOIP-HOILと新規の直鎖状ポリユビキチン鎖依存活性化分子を共発現させ、上記 IIIで見出した反応が細胞内でも同様に起こるかどうか調べた。その結果、CYLDはCYLD-E3リガーゼ依存的に、細胞内でK48型ポリユビキチン化され分解されることが分かった。変異体解析によるCYLD上のユビキチン化部位の同定にも成功した。　２）NF-κBシグナルへの影響：CYLDはLUBAC依存的NF-κBを抑制することが知られている。そこで、NF-κBシグナルにおけるCYLD-E3リガーゼの役割についてpNF-κB-Lucを用いたルシフェラーゼアッセイにより解析した。その結果、CYLD-E3リガーゼはCYLDの分解を誘導することにより、NF-κBシグナルを促進することが明らかとなった。　３）細胞内局在：CYLD-E3リガーゼは主に、細胞質に局在することが分かった。TNFα処理による細胞内局在の変化は見られなかった。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] High-throughput synthesis of stable isotope-labeled transmembrane proteins for targeted transmembrane proteomics using a wheat germ cell-free protein synthesis system. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takemori N, Takemori A, Matsuoka K, Morishita R, Matsushita N, Aoshima M, Takeda H, Sawasaki T, Endo Y, Higashiyama S.
  • 雑誌名: Mol Biosyst. 巻: 11 号: 2 ページ: 361-365
  • DOI: 10.1039/c4mb00556b
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] MAPK Phosphatase 5 Expression Induced by Influenza and Other RNA Virus Infection Negatively Regulates IRF3 Activation and Type I Interferon Response. (2015)
  • 著者名/発表者名: James SJ, Jiao H, Teh HY, Takahashi H, Png CW, Phoon MC, Suzuki Y, Sawasaki T, Xiao H, Chow VT, Yamamoto N, Reynolds JM, Flavell RA, Dong C, Zhang Y.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 10 号: 10 ページ: 1722-1734
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2015.02.030
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In situ visualization of plasma cells producing antibodies reactive to Porphyromonas gingivalis in periodontitis: The application of the enzyme-labeled antigen method. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mizutani Y, Tsuge S, Takeda H, Hasegawa Y, Shiogama K, Onouchi T, Inada KI, Sawasaki T, Tsutsumi Y.
  • 雑誌名: Molecular Oral Microbiology 巻: In press 号: 4 ページ: 156-173
  • DOI: 10.1111/omi.12052
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Involvement of Hepatitis C Virus NS5A Hyperphosphorylation Mediated by Casein Kinase I-α in Infectious Virus Production. (2014)
  • 著者名/発表者名: Masaki T, Matsunaga S, Takahashi H, Nakashima K, Kimura Y, Ito M, Matsuda M, Murayama A, Kato T, Hirano H, Endo Y, Lemon SM, Wakita T, Sawasaki T, Suzuki T
  • 雑誌名: J Virol 巻: 88(13) 号: 13 ページ: 7541-55
  • DOI: 10.1128/jvi.03170-13
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Pctaire1/Cdk16 promotes skeletal myogenesis by inducing myoblast migration and fusion. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shimizu K, Uematsu A, Imai Y, Sawasaki T.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 588 号: 17 ページ: 3030-3037
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2014.05.060
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] creenCap3: Improving prediction of caspase-3 cleavage sites using experimentally verified noncleavage sites. (2014)
  • 著者名/発表者名: Fu SC, Imai K, Sawasaki T, Tomii K.
  • 雑誌名: Proteomics. 巻: 14 号: 17-18 ページ: 2042-2046
  • DOI: 10.1002/pmic.201400002
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of RFPL3 protein as a novel E3 ubiquitin ligase modulating the integration activity of human immunodeficiency virus, type 1 preintegration complex using a microtiter plate-based assay. (2014)
  • 著者名/発表者名: Tan BH, Suzuki Y, Takahashi H, Ying PH, Takahashi C, Han Q, Chin WX, Chao SH, Sawasaki T, Yamamoto N, Suzuki Y.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 289 号: 38 ページ: 26368-26382
  • DOI: 10.1074/jbc.m114.561662
  • 査読あり
• [雑誌論文] The apoptotic initiator caspase-8: its functional ubiquity and genetic diversity during animal evolution. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakamaki K, Shimizu K, Iwata H, Imai K, Satou Y, Funayama N, Nozaki M, Yajima M, Nishimura O, Higuchi M, Chiba K, Yoshimoto M, Kimura H, Gracey AY, Shimizu T, Tomii K, Gotoh O, Akasaka K, Sawasaki T, Miller DJ.
  • 雑誌名: Mol Biol Evol. 巻: 31 号: 12 ページ: 3282-3301
  • DOI: 10.1093/molbev/msu260
  • 査読あり
• [雑誌論文] Overexpression of the PAP1 transcription factor reveals a complex regulation of flavonoid and phenylpropanoid metabolism in Nicotiana tabacum plants attacked by Spodoptera litura. (2014)
  • 著者名/発表者名: Mitsunami T., Nishihara M., Galis I., Alamgir K.M., Hojo Y., Fujita K., Sasaki N., Nemoto K., Sawasaki T., Arimura G.
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 号: 9 ページ: e108849-e108849
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0108849
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The ligand binding ability of dopamine D1 receptors synthesized using a wheat germ cell-free protein synthesis system with liposomes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Arimitsu E, Ogasawara T, Takeda H, Sawasaki T, Ikeda Y, Hiasa Y, Maeyama K.
  • 雑誌名: Eur J Pharmacol. 巻: 745 ページ: 117-122
  • DOI: 10.1016/j.ejphar.2014.10.011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Myosin phosphatase is inactivated by caspase-3 cleavage and phosphorylation of myosin phosphatase targeting subunit 1 during apoptosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Iwasaki T, Katayama T, Kohama K, Endo Y, Sawasaki T.
  • 雑誌名: Mol Biol Cell 巻: 24 号: 6 ページ: 748-756
  • DOI: 10.1091/mbc.e11-08-0740
  • 査読あり
• [雑誌論文] Anti-interleukin-5 and multiple autoantibodies are associated with human atherosclerotic diseases and serum interleukin-5 levels (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishigami T, Abe K, Aoki I, Minegishi S, Ryo A, Matsunaga S, Matsuoka K, Taleda H, Sawasaki T, Umemura S, Endoh Y.
  • 雑誌名: FASEB J 巻: 27 号: 9 ページ: 3437-45
  • DOI: 10.1096/fj.12-222653
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nek5, a novel substrate for caspase-3, promotes skeletal muscle differentiation by un-reaulatine casnase activity (2013)
  • 著者名/発表者名: 清水康平、澤崎達也
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: Vol.587 号: 14 ページ: 2219-2225
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.05.049
  • 査読あり
• [雑誌論文] Suppression of DS1 phosphatidic acid phosphatase confirms resistance to Ralstonia solanacearum in Nicotiana benthamiana (2013)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Nakano, Masahiro Nishihara, Hirofumi Yoshioka, Kouhei Ohnishi, Yasufumi Hikichi, A kinori Kiba
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 号: 9 ページ: e75124-e75124
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0075124
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cell-free based protein array technology for analyses of protein kinases and ubiquitin ligases. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sawasaki T, Takeda H, Takahashi H, Nemoto K.
  • 雑誌名: Seikagaku 巻: 85 ページ: 438-446
  • NAID: 10031184264
• [学会発表] 大規模生化学的解析はバイオインフォマティクス解析を凌駕するか？ (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 産総研・東京大学合同 創薬等支援技術基盤プラットフォーム(PDIS)ワークショップ ～実験とバイオインフォマティクスの協奏による構造生命科学～
  • 発表場所: 産総研臨海副都心センター別館（東京都江東区）
  • 年月日: 2014-12-18
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞技術を基盤とした化合物スクリーニング (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞HTSを用いた創薬基盤技術 (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第87回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都国際会議場（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
  • 招待講演
• [学会発表] 無細胞技術を基盤とした自己抗体探索によるアンチエイジング医学のブレークスルーをめざして (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第14回 日本抗加齢医学会総会
  • 発表場所: 大阪国際会議場（大阪府大阪市）
  • 年月日: 2014-06-06 – 2014-06-08
  • 招待講演
• [学会発表] GPCR研究のためのコムギ無細胞系プロテオリポソーム技術 (2014)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 第１１回GPCR研究会
  • 発表場所: 日本科学未来館 みらいCANホール（東京都江東区）
  • 年月日: 2014-05-09 – 2014-05-10
  • 招待講演
• [学会発表] 創薬等プラットフォームにおけるコムギ無細胞基盤膜蛋白質生産と高親和膜蛋白質抗体作成技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也、竹田 浩之
  • 学会等名: 第13回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: とりぎん文化会館（鳥取）
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜タンパク質解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也、竹田 浩之
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知）
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成系を基盤とした膜蛋白質の合成・精製と細胞への導入技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也, 竹田 浩之
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: ウインクあいち（愛知）
  • 招待講演
• [学会発表] 無細胞プロテインアレイを用いたプロテインキナーゼおよびユビキチンリガーゼの基質タンパク質探索技術 (2013)
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也, 根本 圭一郎, 高橋 宏隆, 竹田 浩之
  • 学会等名: 第86回日本生化学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞蛋白質合成技術と乳がんバイオマーカー探索
  • 著者名/発表者名: 澤崎 達也
  • 学会等名: 日本プロテオーム学会主催プロテオサイエンスセンター JHUPOサテライトジョイントシンポジウム
  • 発表場所: 愛媛大学総合情報メデイアセンター・メディアホール
  • 招待講演
• [備考] CELL- FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/
• [備考] CELL-FREE Technology
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/pg02.html