Elucidation of pH signals in biological systems
| Project Area | Establishment of pH Biology |
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| Project/Area Number |
20H05791
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Transformative Research Areas, Section (III)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荻沼 政之 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (50825966)
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| Project Period (FY) |
2020-10-02 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥40,170,000 (Direct Cost: ¥30,900,000、Indirect Cost: ¥9,270,000)
Fiscal Year 2022: ¥13,390,000 (Direct Cost: ¥10,300,000、Indirect Cost: ¥3,090,000)
Fiscal Year 2021: ¥13,390,000 (Direct Cost: ¥10,300,000、Indirect Cost: ¥3,090,000)
Fiscal Year 2020: ¥13,390,000 (Direct Cost: ¥10,300,000、Indirect Cost: ¥3,090,000)
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| Keywords | イオンチャネル / 濃度勾配 / 遺伝子組換え魚類 / 糖鎖 / pH / エンドソーム / ミクログリア / 硬骨魚類 / 酸性化 |
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| Outline of Research at the Start |
pHは生存に必須のパラメーターであり、その変化はストレスとなる一方で生命機能のシグナルとして働く。しかしその詳細な仕組みと意義は明らかではない。本研究では細胞質局所「pH場」の実態を発現系細胞やモデル生物のin vivo胚などにおいて詳細に明らかにするとともに、胚発生や神経機能や老化などのマクロな生物現象での生理的意義を解明することで、従来のホメオスタシス調節因子としての細胞内pHのコンセプトを超えたシグナル調節因子としての細胞内「pH場」の概念を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
[研究代表者 岡村]
(1)野生型及びHv1/VSOP欠損マウスより初代培養ミクログリアを調整し、電気生理学的手法によりエンドソーム上でHv1活性が見られるかを検証した。その結果、野生型由来の細胞のみに電位依存的なH+電流が観察され、エンドソームにおいてHv1/VSOPが機能することが示された。MDCK細胞にBioID法を適用し、Hv1/VSOP含有小胞と相互作用する可能性のある複数の候補分子を得た。この中から重要な分子を選定し、そのノックアウトマウスを入手した。
(2)Hv1/VSOPがゴルジのpH制御を通して糖鎖修飾に関わる可能性を検討するため、正常型Hv1とイオンチャネル不活性型Hv1/VSOPをそれぞれ安定に発現する２種類の細胞株（マクロファージ系培養細胞RAW264.7および神経芽細胞Neuro2A）を用いて、45種類のレクチンを固相化したレクチンアレイで糖鎖修飾の違いを比較した。しかし２種類の細胞株に共通した糖鎖修飾の違いは検出されなかった。
(3) キリフィッシュHv1/VSOPのオルソログをRT-PCRによりクローニングし、パッチクランプ法によりプロトンチャネルとして機能することを確認した。
[研究分担者 荻沼]
昨年度までに作製したpHレポーターフィッシュを用いて、休眠胚の細胞内pHの状態を１細胞レベルで解析したところ、胚の体幹部の細胞内pHが通常時に比べ約0.5酸性化していた。興味深い事に、胚の周辺部の細胞内pHは通常時と変わらず中性であった。さらに、薬剤処理によって人為的に通常発生中の胚の細胞内 pHを酸性化した結果、休眠胚と似た状態を引き起こすことができ、休眠時に能動的に胚の一部の細胞を酸性化する分子機構が存在し、それが休眠移行に重要な役割を果たす可能性が示された。Hv1/VSOPノックアウトキリフィッシュを作製し、正常に発生することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
交付申請時に計画した各研究項目について、「6.研究実績の概要」に記述した研究計画が着実に実施された。これらによりマウスのHv1/VSOPを含む細胞内小胞と相互作用する可能性のある分子を見つけることに成功し、Hv1/VSOPをノックアウトしたキリフィッシュを得るなどの進捗が見られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内膜のHv1/VSOPの機能を、細胞膜の分子の機能と区別して解析するため、後者にのみ作用する薬物を用いた抑制実験を試みる。Hv1/VSOP含有小胞近傍に存在しアクチン繊維形成を仲介する候補分子の遺伝子について、ミクログリア特異的なノックアウトマウスの掛け合わせをすすめる。キリフィッシュについてはHv1/VSOPノックアウトフィッシュの形態や発生における表現型を探索するとともに、休眠現象に特徴的な細胞現象に着目して酸性化の意義を明らかにする。
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Report
(2 results)
Research Products
(31 results)
