Wntシグナルネットワークを基盤とした歯槽骨代謝回転制御法の開発

• Project/Area Number: 16H02691
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Orthodontics/Pediatric dentistry
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 小林 泰浩 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 教授 (20264252)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平賀 徹 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70322170) ; 高橋 直之 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 特任教授 (90119222) ; 山下 照仁 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 准教授 (90302893) ; 上原 俊介 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (90434480)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥45,890,000 (Direct Cost: ¥35,300,000、Indirect Cost: ¥10,590,000); Fiscal Year 2019: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2018: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2017: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2016: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
• Keywords: 骨代謝回転 / 破骨細胞 / 骨芽細胞 / Wnt5a / Sfrp5 / 骨吸収 / 骨形成 / Wnt / Pkn3 / Ｗｎｔ５ａ / Ｓｆｒｐ５ / 歯槽骨

Outline of Annual Research Achievements

１）Sfrp5による骨量増加作用の解明：骨芽細胞の培養にSfrp5を添加すると、BMP2誘導性の骨芽細胞分化が促進される。そこで、リアルタイムPCRを用いて骨芽細胞マーカーの遺伝子発現を調べた。Sfrp5の添加により、Osterix, Alpl, Bglapの発現が亢進した。Wnt-beta-cateninシグナルの標的遺伝子であるAxin2およびLef1の発現は、Sfrp5の添加により変化しなかった。この結果は、Sfrp5がWnt-beta-cateninシグナル以外のシグナルを活性化し、石灰化を亢進していることを示唆する。
２）Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性機構の解明: Wnt5a-Ror2シグナルの下流で活性化されるRhoエフェクター分子Pkn3の骨吸収における役割を明らかにするため、Pkn3ノックアウトマウス (KO) の大腿骨を解析した。microCT解析では、野生型にくらべ、Pkn3KOの大腿骨の海綿骨量は増加した。骨形態計測の結果、Pkn3KOの骨芽細胞数、石灰化速度など骨形成パラメーターは、野生型と変わりなかった。一方、破骨細胞数に変化を認めなかったものの、Pkn3KOの骨吸収面は、顕著に低下した。また、骨吸収マーカーである血清CTXのPkn3KOで、顕著に減少した。これらの結果は、Pkn3KOマウスでは、破骨細胞の骨吸収機能の低下による骨吸収不全を呈することが明らかになった。破骨細胞前駆細胞を象牙切片上で、RANKLとM-CSF存在下で培養し、破骨細胞形成を誘導した。Pkn3KO由来の破骨細胞前駆細は、野生型と同様に破骨細胞に分化した。一方、骨吸収窩数は、Pkn3KO由来の破骨細胞の培養で、顕著に減少した。以上から、Pkn3は、破骨細胞の骨吸収機能に重要であることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

１）Sfrp5による骨量増加作用の解明および２）Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性機構の解明ともにおおむね順調に進行している。１）に関して、Sfrp5の抗体を用いた免疫沈降法で、Sfrp5に結合する分子の同定を試みている。しかし、免疫沈降物のSDS-PAGE解析において、Sfrp5に結合する特異的なバンドが得られていない。

Strategy for Future Research Activity

Sfrp5の抗体を用いて免疫沈降を行っているが、タグつきのSfrp5を発現させて、タグに対する抗体を用いて、免疫沈降を試みる。
骨芽細胞の培養系で、発現上昇するWntリガンドを同定し、そのWntとSfrp5が結合するかを検討する。
Pkn3が破骨細胞の骨吸収機能を調節する機構を免疫沈降法を用いて明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] The HIV co-receptor CCR5 regulates osteoclast function. (2018)
  • Author(s): Ji-Won Lee, Akiyoshi Hoshino, Kazuki Inoue, Takashi Saitou, Shunsuke Uehara, Yasuhiro Kobayashi, Satoshi Ueha, Kouji Matsushima, Akira Yamaguchi, Yuuki Imai, Tadahiro Iimura
  • Journal Title: Nat Commun. Volume: 8 Pages: 2226-2226
  • DOI: 10.1038/s41467-017-02368-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Osteogenic factor Runx2 marks a subset of leptin receptor-positive cells that sit atop the bone marrow stromal cell hierarchy (2017)
  • Author(s): Yang Mengyu、Arai Atsushi、Udagawa Nobuyuki、Hiraga Toru、Lijuan Zhao、Ito Susumu、Komori Toshihisa、Moriishi Takeshi、Matsuo Koichi、Shimoda Kouji、Zahalka Ali H.、Kobayashi Yasuhiro、Takahashi Naoyuki、Mizoguchi Toshihide
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 7 Pages: 4298-4298
  • DOI: 10.1038/s41598-017-05401-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Bone Formation Is Coupled to Resorption Via Suppression of Sclerostin Expression by Osteoclasts (2017)
  • Author(s): Koide M, Kobayashi Y, Yamashita T, Uehara S, Nakamura M, Hiraoka BY, Ozaki Y, Iimura T, Yasuda H, Takahashi N and Udagawa N
  • Journal Title: Journal of Bone and Mineral Research Volume: 32 Pages: 2074-2086
  • DOI: 10.1002/jbmr.3175
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Treatment of OPG-deficient mice with WP9QY, a RANKL-binding peptide, recovers alveolar bone loss by suppressing osteoclastogenesis and enhancing osteoblastogenesis. (2017)
  • Author(s): Ozaki Yuki、Koide Masanori、Furuya Yuriko、Ninomiya Tadashi、Yasuda Hisataka、Nakamura Midori、Kobayashi Yasuhiro、Takahashi Naoyuki、Yoshinari Nobuo、Udagawa Nobuyuki
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0184904
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protein kinase N3 promotes bone resorption by osteoclasts in response to Wnt5a-Ror2 signaling (2017)
  • Author(s): Uehara S, Udagawa N, Mukai H, Ishihara A, Maeda K, Yamashita T, Murakami K, Nishita M, Nakamura T, Kato S, Minami Y, Takahashi N and Kobayashi Y
  • Journal Title: Sci. Signaling Volume: 10
  • DOI: 10.1126/scisignal.aan0023
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A Jak1/2 inhibitor, baricitinib, inhibits osteoclastogenesis by suppressing RANKL expression in osteoblasts in vitro (2017)
  • Author(s): Murakami K, Kobayashi Y, Uehara S, Suzuki T, Koide M, Yamashita T, Nakamura M, Takahashi N, Kato H, Udagawa N and Nakamura Y
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0181126
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Platypus and opossum calcitonins exhibit strong activities, even though they belong to mammals (2017)
  • Author(s): Yamashita T, Udagawa N, Thirukonda GJ, Uehara S, Yamauchi H, Suzuki N, Li F, Kobayashi Y, Takahashi N.
  • Journal Title: Gen Comp Endocrinol Volume: 246 Pages: 270-278
  • DOI: 10.1016/j.ygcen.2017.01.001
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The dynamin inhibitor dynasore inhibits bone resorption by rapidly disrupting actin rings of osteoclasts (2016)
  • Author(s): Thirukonda GJ, Uehara S, Nakayama T, Yamashita T, Nakamura Y, Mizoguchi T, Takahashi N, Yagami K, Udagawa N, Kobayashi Y.
  • Journal Title: J Bone Miner Metab Volume: 34 Pages: 395-405
  • DOI: 10.1007/s00774-015-0683-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Specification of tissue-resident macrophages during organogenesis. (2016)
  • Author(s): Mass E, Ballesteros I, Farlik M, Halbritter F, Günther P, Crozet L, Jacome-Galarza CE, Händler K, Klughammer J, Kobayashi Y, Gomez-Perdiguero E, Schultze JL, Beyer M, Bock C, Geissmann F
  • Journal Title: Ｓｃｉｅｎｃｅ Volume: ３５３
  • DOI: 10.1126/science.aaf4238
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of embryonic precursor cells that differentiate into thymic epithelial cells expressing autoimmune regulator. (2016)
  • Author(s): Akiyama N, Takizawa N, Miyauchi M, Yanai H, Tateishi R, Shinzawa M, Yoshinaga R, Kurihara M, Demizu Y, Yasuda H, Yagi S, Wu G, Matsumoto M, Sakamoto R, Yoshida N, Penninger JM, Kobayashi Y, Inoue J, Akiyama T.
  • Journal Title: J Exp Med Volume: 213 Pages: 1441-1458
  • DOI: 10.1084/jem.20151780
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The regulation of osteoclast differentiation by Wnt signals (2016)
  • Author(s): Kobayashi Y, Uehara S, Udagawa N, Takahashi N.
  • Journal Title: Bonekey Rep Volume: 159 Pages: 387-392
  • DOI: 10.1093/jb/mvv124
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant