Wntシグナルネットワークを基盤とした歯槽骨代謝回転制御法の開発

• Project/Area Number: 16H02691
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Orthodontics/Pediatric dentistry
• Research Institution: Matsumoto Dental University
• Principal Investigator: 小林 泰浩 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 教授 (20264252)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平賀 徹 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70322170) ; 高橋 直之 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 特任教授 (90119222) ; 山下 照仁 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 准教授 (90302893) ; 上原 俊介 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (90434480)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥45,890,000 (Direct Cost: ¥35,300,000、Indirect Cost: ¥10,590,000); Fiscal Year 2020: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2019: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2018: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2017: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000); Fiscal Year 2016: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
• Keywords: 骨代謝回転 / 破骨細胞 / 骨芽細胞 / Sfrp5 / Wnt / Wnt5a / 骨吸収 / 骨形成 / Pkn3 / Ｗｎｔ５ａ / Ｓｆｒｐ５ / 歯槽骨

Outline of Annual Research Achievements

１）Sfrp5による骨量増加作用の解明：骨芽細胞の培養にリコンビナントSfrp5を添加したところ、石灰化結節形成の亢進と骨芽細胞マーカー遺伝子の発現亢進が認められた。そこで、RNAシークエンス法を用いて、Sfrp5添加によって発現が上昇する遺伝子を網羅的に解析した。パスウェイ解析の結果、Hhシグナルが亢進することが明らかになった。さらに、リアルタイムPCR解析を行った。その結果Sfrp5の添加によって、Ihhの発現が促進し、Hhの標的遺伝子の発現亢進が認められた。免疫沈降法と質量分析を用いて、Sfrp5と結合するタンパク質の同定を試みたが、同定には至らなかった。
２）Wnt5a-Ror2シグナルによる破骨細胞活性化機構の解明:Pkn3阻害剤の探索。破骨細胞の培養において、Pkn3阻害剤Xの効果を検討した。Xは、用量依存的に破骨細胞のアクチンリングの形成および吸収窩形成を抑制した。つまり、破骨細胞の骨吸収活性を抑制した。
３）破骨細胞によるスクレロスチン発現抑制機構：破骨細胞特異的Wnt5aコンディショナルノックアウトマウス（Wnt5a-cKO）の解析を行った。メスのWnt5a-cKOマウスは、骨量減少を示した。骨形態計測の結果、骨形成と骨吸収がともに低下した低回転型骨量減少を示した。Wnt5a-cKOマウスの骨組織では、beta-catenin陽性細胞が減少しておりWnt/beta-cateninシグナルが低下していた。さらに、海綿骨においてSostの発現が上昇していた。この結果は、破骨細胞のWnt5aがスクレロスチンの発現を抑制する可能性を示す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Sfrp5による骨量増加作用の解明では、sfrp5が骨芽細胞分化を促進する機構の一端が明らかになりつつある。しかし、Sfrp5がどの分子と結合するかが明らかになっていない。培養実験の結果、Xは破骨細胞による骨吸収を抑制することが示された。しかし、生体内での効果は未知である。

Strategy for Future Research Activity

１）Sfrp5が結合する分子を明らかにし、どのようにIhhの発現を誘導するかを解明する。卵巣摘出モデルなどを用いて、骨代謝に対するXの効果を生体内で検討する。さらに、Sfrp5の下流でHhシグナルが石灰化に関与するか？ShRNAを用いたノックダウン法やHh阻害剤を用いて検討する。
２）骨粗鬆症モデルにおいて、阻害剤Xの効果を検証する。
３）Wnt関連遺伝子の発現を解析し、Wnt5aｃKOの骨形成が低下した機構を明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] Regulatory mechanisms of sclerostin expression during bone remodeling (2018)
  • Author(s): Koide Masanori、Kobayashi Yasuhiro
  • Journal Title: Journal of Bone and Mineral Metabolism Volume: 37 Pages: 9-17
  • DOI: 10.1007/s00774-018-0971-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Olfactomedin-like protein OLFML1 inhibits Hippo signaling and mineralization in osteoblasts (2018)
  • Author(s): Murakami K, Kikugawa S, Kobayashi Y, Uehara S, Suzuki T, Kato H, Udagawa N, Nakamura Y
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun. Volume: 28 Pages: 419-425
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.09.112
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Non-canonical Wnt signals regulate cytoskeletal remodeling in osteoclasts (2018)
  • Author(s): Uehara S, Udagawa N, Kobayashi Y
  • Journal Title: Cell Mol Life Sci. Volume: 75 Pages: 3683-3692
  • DOI: 10.1007/s00018-018-2881-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Tumor Necrosis Factor Superfamily Member RANKL Suppresses Effector Cytokine Production in Group 3 Innate Lymphoid Cells (2018)
  • Author(s): Bando Jennifer K.、Gilfillan Susan、Song Christina、McDonald Keely G.、Huang Stanley C.-C.、Newberry Rodney D.、Kobayashi Yasuhiro、Allan David S.J.、Carlyle James R.、Cella Marina、Colonna Marco
  • Journal Title: Immunity Volume: 48
  • DOI: 10.1016/j.immuni.2018.04.012
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Roles of non-canonical Wnt signaling pathways in bone resorption (2018)
  • Author(s): Kobayashi Yasuhiro、Uehara Shunsuke、Udagawa Nobuyuki
  • Journal Title: Journal of Oral Biosciences Volume: 60 Pages: 31-35
  • DOI: 10.1016/j.job.2018.03.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The HIV co-receptor CCR5 regulates osteoclast function (2018)
  • Author(s): Lee JW, Hoshino A, Inoue K, Saitou T, Uehara S, Kobayashi Y, Ueha S, Matsushima K, Yamaguchi A, Imai Y, Iimura T.
  • Journal Title: Nature communications Volume: 8 Pages: 2226-2226
  • DOI: 10.1038/s41467-017-02368-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Osteogenic factor Runx2 marks a subset of leptin receptor-positive cells that sit atop the bone marrow stromal cell hierarchy (2017)
  • Author(s): Yang Mengyu、Arai Atsushi、Udagawa Nobuyuki、Hiraga Toru、Lijuan Zhao、Ito Susumu、Komori Toshihisa、Moriishi Takeshi、Matsuo Koichi、Shimoda Kouji、Zahalka Ali H.、Kobayashi Yasuhiro、Takahashi Naoyuki、Mizoguchi Toshihide
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 7 Pages: 4298-4298
  • DOI: 10.1038/s41598-017-05401-1
  • NAID: 120006576162
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Bone Formation Is Coupled to Resorption Via Suppression of Sclerostin Expression by Osteoclasts (2017)
  • Author(s): Koide M, Kobayashi Y, Yamashita T, Uehara S, Nakamura M, Hiraoka BY, Ozaki Y, Iimura T, Yasuda H, Takahashi N and Udagawa N
  • Journal Title: Journal of Bone and Mineral Research Volume: 32 Pages: 2074-2086
  • DOI: 10.1002/jbmr.3175
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Treatment of OPG-deficient mice with WP9QY, a RANKL-binding peptide, recovers alveolar bone loss by suppressing osteoclastogenesis and enhancing osteoblastogenesis. (2017)
  • Author(s): Ozaki Yuki、Koide Masanori、Furuya Yuriko、Ninomiya Tadashi、Yasuda Hisataka、Nakamura Midori、Kobayashi Yasuhiro、Takahashi Naoyuki、Yoshinari Nobuo、Udagawa Nobuyuki
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0184904
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protein kinase N3 promotes bone resorption by osteoclasts in response to Wnt5a-Ror2 signaling (2017)
  • Author(s): Uehara S, Udagawa N, Mukai H, Ishihara A, Maeda K, Yamashita T, Murakami K, Nishita M, Nakamura T, Kato S, Minami Y, Takahashi N and Kobayashi Y
  • Journal Title: Sci. Signaling Volume: 10
  • DOI: 10.1126/scisignal.aan0023
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A Jak1/2 inhibitor, baricitinib, inhibits osteoclastogenesis by suppressing RANKL expression in osteoblasts in vitro (2017)
  • Author(s): Murakami K, Kobayashi Y, Uehara S, Suzuki T, Koide M, Yamashita T, Nakamura M, Takahashi N, Kato H, Udagawa N and Nakamura Y
  • Journal Title: PLoS One Volume: 12
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0181126
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Platypus and opossum calcitonins exhibit strong activities, even though they belong to mammals (2017)
  • Author(s): Yamashita T, Udagawa N, Thirukonda GJ, Uehara S, Yamauchi H, Suzuki N, Li F, Kobayashi Y, Takahashi N.
  • Journal Title: Gen Comp Endocrinol Volume: 246 Pages: 270-278
  • DOI: 10.1016/j.ygcen.2017.01.001
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The dynamin inhibitor dynasore inhibits bone resorption by rapidly disrupting actin rings of osteoclasts (2016)
  • Author(s): Thirukonda GJ, Uehara S, Nakayama T, Yamashita T, Nakamura Y, Mizoguchi T, Takahashi N, Yagami K, Udagawa N, Kobayashi Y.
  • Journal Title: J Bone Miner Metab Volume: 34 Pages: 395-405
  • DOI: 10.1007/s00774-015-0683-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Specification of tissue-resident macrophages during organogenesis. (2016)
  • Author(s): Mass E, Ballesteros I, Farlik M, Halbritter F, Günther P, Crozet L, Jacome-Galarza CE, Händler K, Klughammer J, Kobayashi Y, Gomez-Perdiguero E, Schultze JL, Beyer M, Bock C, Geissmann F
  • Journal Title: Ｓｃｉｅｎｃｅ Volume: ３５３
  • DOI: 10.1126/science.aaf4238
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification of embryonic precursor cells that differentiate into thymic epithelial cells expressing autoimmune regulator. (2016)
  • Author(s): Akiyama N, Takizawa N, Miyauchi M, Yanai H, Tateishi R, Shinzawa M, Yoshinaga R, Kurihara M, Demizu Y, Yasuda H, Yagi S, Wu G, Matsumoto M, Sakamoto R, Yoshida N, Penninger JM, Kobayashi Y, Inoue J, Akiyama T.
  • Journal Title: J Exp Med Volume: 213 Pages: 1441-1458
  • DOI: 10.1084/jem.20151780
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Regulation of bone metabolism by Wnt signals. (2016)
  • Author(s): Kobayashi Y, Uehara S, Koide M, Takahashi N
  • Journal Title: J Biochem. Volume: 4 Pages: 387-392
  • DOI: 10.1093/jb/mvv124
  • NAID: 40020784053
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant