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Structural and Functional analyses of iron-sulfur clusters biogenesis systems under the anaerobic conditions

Research Project

Project/Area Number 16H04754
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Research Field Structural biochemistry
Research InstitutionUniversity of Miyazaki

Principal Investigator

和田 啓  宮崎大学, 医学部, 准教授 (80379304)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 高橋 康弘  埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
藤田 祐一  名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80222264)
福山 恵一  大阪大学, 工学研究科, 招へい研究員 (80032283)
Project Period (FY) 2016-04-01 – 2020-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2019: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2018: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2017: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2016: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Keywords鉄硫黄クラスター / 結晶構造解析 / DNA結合タンパク質 / 結晶構造 / 無酸素実験 / X線結晶構造解析 / センサー蛋白質 / 蛋白質 / 酵素
Outline of Annual Research Achievements

鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-S クラスターが生体内において、どこでどのように生合成されるのか、その分子機構解明は遅々として進んでいない。この原因は、Fe-S クラスターの酸素へ不安定性にあり、遺伝学的には生合成マシナリー群は同定されたものの、合成途上のクラスターを実験的に捉えた例は皆無である。
本課題では、細胞内をミミックした無酸素条件下での機能解析を遂行し、クラスター合成反応を試験管内でコントロールする新たな系(無細胞"ex situ"系)を確立することを目指している。さらに、ダイナミックな構造変化を伴う生合成コア複合体の動きを固定・制御することで、多段階に亘る合成途上の中間体クラスターをトラップし、それらの配位構造から生合成メカニズムを解き明かす。また、無細胞クラスター合成系を利用した新規センサーFe-S タンパク質 CnfR の構造機能解析も展開する。これらの目的を達成するために、本年度は以下の項目を実施した。
・H28年度に作製した変異コア複合体の発現・精製を進め、機能残基はβ-ヘリックスコアドメインN末端側の機能領域に位置しており、Fe-Sクラスターの新規形成部位と予想されるSufBとSufDの会合面までは 25A以上離れていることを明らかにした。さらに、SufBのβ-ヘリックスコアドメインの内部に硫黄原子を運搬するトンネルを見出した。
・前年度に作製したCnfRの発現系を用いて、今年度は無酸素条件下での精製を進めた。その結果、C末端に精製Tagを付加したCnfRを用いて、Fe-Sクラスターが結合した状態での大量精製に成功した。このFe-Sクラスター結合型CnfRの結晶化スクリーニングを進めた。さらに、ゲルシフトアッセイによりCnfRが結合するDNA断片の検討を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

平成29年度の計画書では、[1]コア複合体の精製、[2]Fe-Sクラスター結合型CnfR の精製・結晶化スクリーニングを掲げていた。前年度の実験計画の遅れを取り戻し、さらに申請段階での平成29年度の実施項目は実施済みである。さらに、次年度に計画していたCnfRのゲルシフトアッセイも進めることができており、当初の計画以上に進展している。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度の計画書では、[1]コア複合体の精製、[2]Fe-Sクラスター結合型CnfR の精製・結晶化スクリーニングを掲げていた。前年度の実験計画の遅れを取り戻し、さらに申請段階での平成29年度の実施項目を順調に進めることが出来ている。既に平成30年度の実施計画は前倒しで進ませているが、実験項目は計画書通りに進める予定である。

Report

(2 results)
  • 2017 Annual Research Report
  • 2016 Annual Research Report

Research Products

(26 results)

All 2018 2017 2016

All Journal Article Presentation

  • [Journal Article] Structure-Dependent Binding of hnRNPA1 to Telomere RNA2017

    • Author(s)
      Liu Xiao、Ishizuka Takumi、Bao Hong-Liang、Wada Kei、Takeda Yuma、Iida Keisuke、Nagasawa Kazuo、Yang Danzhou、Xu Yan
    • Journal Title

      Journal of the American Chemical Society

      Volume: 139 Pages: 7533-7539

    • DOI
      10.1021/jacs.7b01599
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Mapping the key residues of SufB and SufD essential for biosynthesis of iron-sulfur clusters.2017

    • Author(s)
      Yuda Eiki、Tanaka Naoyuki、Fujishiro Takashi、Yokoyama Nao、Hirabayashi Kei、Fukuyama Keiichi、Wada Kei、Takahashi Yasuhiro
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 7 Pages: 1-12

    • DOI
      10.1038/s41598-017-09846-2
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Synthesis and evaluation of the inhibitory activity of the four stereoisomers of the potent and selective human γ-glutamyl transpeptidase inhibitor GGsTop2017

    • Author(s)
      Watanabe Bunta、Tabuchi Yukiko、Wada Kei、Hiratake Jun
    • Journal Title

      Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters

      Volume: 27 Pages: 4920-4924

    • DOI
      10.1016/j.bmcl.2017.09.017
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] "化学機械エンジン" と呼ばれるタンパク質群 - ABCタンパク質がもつ機能性ドメインの多2017

    • Author(s)
      和田啓、高橋康弘
    • Journal Title

      化学 ( 化学同人 )

      Volume: 72 Pages: 70-71

    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A substrate-bound structure of cyanobacteria biliverdin reductase identifies stacked substrates as critical for activity.2017

    • Author(s)
      Haruna Takao, Kei Hirabayashi, Yuki Nishigaya, Haruna Kouriki, Tetsuko Nakaniwa, Yoshinori Hagiwara, Jiro Harada, Hideaki Sato, Toshimasa Yamazaki, Yoichi Sakakibara, Masahito Suiko, Yujiro Asada, Yasuhiro Takahashi, Ken Yamamoto, Keiichi Fukuyama, Masakazu Sugishima, and Kei Wada
    • Journal Title

      Nat Commun

      Volume: 8 Pages: 1-10

    • DOI
      10.1038/ncomms14397
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Atomic-resolution structure of the phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase I86D mutant in complex with fully protonated biliverdin2016

    • Author(s)
      Hagiwara Y, Wada K, Irikawa T, Sato H, Unno M, Yamamoto K, Fukuyama K, Sugishima M
    • Journal Title

      FEBS Letters

      Volume: 590 Pages: 3425-3434

    • DOI
      10.1002/1873-3468.12387
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Phosphonate-based irreversible inhibitors of human γ-glutamyl transpeptidase (GGT). GGsTop is a non-toxic and highly selective inhibitor with critical electrostatic interaction with an active-site residue Lys562 for enhanced inhibitory activity2016

    • Author(s)
      Akane Kamiyama, Mado Nakajima, Liyou Han, Kei Wada, Masaharu Mizutani, Yukio Tabuchi, Akiko Kojima-Yuasa, Isao Matsui-Yuasa, Hideyuki Suzuki, Keiichi Fukuyama, Bunta Watanabe, Jun Hiratake
    • Journal Title

      Bioorganic & Medicinal Chemistry

      Volume: 24 Pages: 5340-5352

    • DOI
      10.1016/j.bmc.2016.08.050
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ビリン還元酵素PcyAと基質ビリベルジン複合体の中性子結晶構造解析で見えてきたもの2016

    • Author(s)
      海野昌喜、日下勝弘、玉田太郎、杉島正一、和田啓、萩原義徳、福山恵一
    • Journal Title

      日本中性子科学会誌「波紋」

      Volume: 26 Pages: 130-134

    • NAID
      130007510639
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] 立体構造に基づいたγ-グルタミルトランスペプチダーゼの反応機構とこの阻害剤開発に向けて2018

    • Author(s)
      和田啓
    • Organizer
      日本農芸化学会2018年度大会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 新生児黄疸の原因蛋白質ビリベルジン還元酵素の反応機構2017

    • Author(s)
      高尾春奈、福山恵一、杉島正一、和田啓
    • Organizer
      平成29年度日本生化学会九州支部例会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] 窒素固定性シアノバクテリアにおける窒素固定遺伝子群の転写活性化タンパク質CnfR の低酸素感知とDNA 結合2017

    • Author(s)
      山川壽伯,橋本薫槻,辻本良真,和田啓,藤田祐一
    • Organizer
      日本生化学会中部支部第81回例会・シンポジウム
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Protonation States and Reduction Activities of PcyA-Biliverdin and Its I86D Mutant Protein-Biliverdin Complexes Revealed by Neutron and X-ray Crystallographic Analyses2017

    • Author(s)
      Fukuyama, K., Wada, K., Sugishima, M., Unno, M.
    • Organizer
      13th International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors of Photosynthetic Organisms (ICTPPO)
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] Crystal Structure of Cyanobacterial Biliverdin Reductase Reveals Two Biliverdin Molecules Bind to the One Catalytic Cleft2017

    • Author(s)
      Masakazu Sugishima, Haruna Takao, Yoshinori Hagiwara,Ken Yamamoto, Keiichi Fukuyama, Kei Wada
    • Organizer
      13th International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors of Photosynthetic Organisms (ICTPPO)
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] 新生児黄疸を引き起こす蛋白質ビリベルジン還元酵素の 基質結合様式と反応機構2017

    • Author(s)
      高尾春奈、福山恵一、杉島正一、和田啓
    • Organizer
      平成29年度 日本結晶学会年会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] ビリン還元酵素PcyA変異体I86D-BV複合体の中性子結晶構造2017

    • Author(s)
      五十嵐啓介,杉島正一, 和田啓, 萩原義徳, 日下勝弘, 福山恵一,Andreas Ostermann,海野昌喜
    • Organizer
      平成29年度 日本結晶学会年会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 黄疸の原因物質ビリルビンの生成反応機構の解明-ビリベルジン還元酵素-基質複合体の結晶構造解析-2017

    • Author(s)
      高尾春奈、福山恵一、杉島正一、和田啓
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] SufBCD複合体への変異導入解析から見えてきた鉄硫黄クラスターの生合成機構2017

    • Author(s)
      湯田 瑛樹、田中 尚志、藤城 貴史 、平林 佳、福山 恵一、和田 啓、高橋 康弘
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] NADPH-シトクロムP450還元酵素とヘム-ヘムオキシゲナーゼ複合体の結晶構造分解能向上への取り組み2017

    • Author(s)
      杉島正一、佐藤秀明、和田啓、山本健
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
    • Related Report
      2017 Annual Research Report
  • [Presentation] 窒素固定性シアノバクテリアLeptolyngbya boryanaの窒素固定遺伝子発現に必須の転 写活性化タンパク質CnfRのDNA結合2017

    • Author(s)
      橋本薫槻、山川壽伯、辻本良真、和田啓、藤田祐一
    • Organizer
      第58回日本植物生理学会年会
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] ヒドロキシメチルビラン合成酵素-阻害剤複合体の結晶構造解析2016

    • Author(s)
      佐藤 秀明,杉島 正一、塚口 舞、増子 隆博、小俣 義明、和田 啓、久枝 良 雄、山本 健、野口 正人
    • Organizer
      第16回日本蛋白質科学会年会
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      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] グルタチオン分解を担うγ-グルタミルトランスペプチダーゼの阻害剤結合構造および 基質認識機構2016

    • Author(s)
      和田啓、平林佳、李春傑、髙尾春奈、鈴木英之、平竹潤、福山恵一
    • Organizer
      第16回日本蛋白質科学会年会
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      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] I86D変異フィコシアノビリン:フェレドキシン還元酵素(PcyA)の精密構造解析から見え てきた活性部位周辺酸性残基の水素化状態2016

    • Author(s)
      萩原義徳、和田啓、入川鉄平、佐藤秀明、海野昌喜、山本健、福山恵一、杉島正 一
    • Organizer
      第89回日本生化学会年会
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] グルタチオン代謝を担うγ-グルタミルトランスペプチダーゼの立体構造と反応機構2016

    • Author(s)
      和田 啓
    • Organizer
      第89回日本生化学会年会
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      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] 鉄硫黄クラスター生合成系の中核成分SufBCD複合体の遺伝生化学的解析2016

    • Author(s)
      湯田瑛樹、田中尚志、平林佳、福山恵一、和田啓、高橋康弘
    • Organizer
      第89回日本生化学会年会
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] ヒト由来γ-グルタミルトランスペプチダーゼ-基質アナログ複合体の結晶構造2016

    • Author(s)
      高尾春奈,鈴木秀之,福山恵一,平竹潤, 和田啓
    • Organizer
      第89回日本生化学会年会
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] Neutron Crystallographic Study of a Bilin Reductase, PcyA2016

    • Author(s)
      Masaki Unno, Masakazu Sugishima, Kei Wada, Yoshinori Hagiwara, Katsuhiro Kusaka, Taro Tamada, Keisuke Igarashi, and Keiichi Fukuyama
    • Organizer
      the 2016 Asian Crystallographic Association Meeting(AsCA 2016)
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Invited

URL: 

Published: 2016-04-21   Modified: 2019-07-17  

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