紫外線暴露により水晶体で発現誘導されるOtx2の白内障発症における役割の解明

Research Project

Project/Area Number	19K07407
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 49010:Pathological biochemistry-related
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	米倉秀人金沢医科大学, 医学部, 教授 (80240373)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	佐々木洋金沢医科大学, 医学部, 教授 (60260840) 大塚哲金沢医科大学, 総合医学研究所, 准教授 (40360515) 池田崇之金沢医科大学, 医学部, 准教授 (00374942) 吉冨泰央金沢医科大学, 医学部, 講師 (80399039) 高辻英仁 (齋藤) 金沢医科大学, 医学部, 助教 (40768959)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	白内障 / 紫外線 / 水晶体 / Otx2 / トランスジェニックマウス
Outline of Research at the Start	白内障は紫外線(UV)の関与が明らかになっているが、発症の分子機構の詳細は未だ不明である。本研究課題の問いは、生体にある水晶体はUV暴露によりどのような遺伝子発現変化が引き起こされ、それがどのように白内障発症につながるのか？である。我々は、UV照射したマウス水晶体で転写因子Otx2の発現が誘導されること、Otx2過剰発現が水晶体上皮細胞の上皮間葉変換(EMT)を引き起こすことを見出した。本研究では、Otx2の過剰発現がどのような白内障を引き起こすか、Otx2の発現を止めると白内障の発症が抑えられるかを個体レベルで明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	白内障は紫外線(UV)の関与が明らかになっているが、発症の分子機構は未だ不明である。本研究課題の問いは、生体にある水晶体はUV暴露によりどのような遺伝子発現変化が引き起こされ、それがどのように白内障発症につながるのか？である。我々は、UV照射したマウス水晶体で転写因子Otx2の発現が誘導されること、Otx2過剰発現が水晶体上皮細胞の上皮間葉変換(EMT)を引き起こすことを見出した。本研究では、Otx2の過剰発現がどのような白内障を引き起こすか、Otx2の発現を止めると白内障の発症が抑えられるかを個体レベルで明らかにする。 2019年度は、(1) 水晶体上皮細胞および水晶体線維細胞で特異的に発現するプロモーター(クリスタリン遺伝子プロモーターにPAX6の結合サイトを挿入したプロモーター)の有効性を、まず培養細胞に導入して発現の確認を行った。さらに、個体レベルの水晶体でプロモーターが機能するかの確認を行った。その結果、水晶体上皮細胞から水晶体移行帯（水晶体線維細胞）の細胞でプロモーターが働き発現が起こることが示された。水晶体核領域での発現は認められなかった。(2) 水晶体上皮細胞および水晶体線維細胞特異的プロモーターの制御下にOtx2 cDNAを連結したトランスジェニックマウス作成用のOtx2発現ベクターを作成した。(3) 作成したOtx2発現ベクターをマウス受精卵に導入した。現在、得られたマウス個体のトランスジーンのコピー数、発現量等の確認を行っているところである。(4) UV-B照射による白内障マウスモデルを作成し、水晶体白濁が起こることの確認を行った。(5) Otx2をノックダウンするsiRNAの設計し、shRNA発現ベクターを作成し、ノックダウンが有効に行われることを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason (1) 水晶体上皮細胞および水晶体線維細胞で特異的に発現するプロモーター(クリスタリン遺伝子プロモーターにPAX6の結合サイトを挿入したプロモーター)の培養細胞および個体レベルでの機能確認、(2) トランスジェニックマウス作成用のOtx2発現ベクターを作成、(3) 作成したOtx2発現ベクターのマウス受精卵への導入、(4) UV-B照射による白内障マウスモデルの作成、(5) Otx2をノックダウンするsiRNAの設計とshRNA発現ベクターの作成、を行い、ほぼ予定通りであり、おおむね順調に進展していると評価できる。
Strategy for Future Research Activity	今後は、(1) 2019度に作成した水晶体細胞特異的Otx2過剰発現トランスジェニックマウスが皮質白内障を発症するかを解析する。具体的には、まず、導入されたOtx2トランスジーンのコピー数の異なるトランスジェニックマウスを数種類選別し、Otx2の発現量と週齢による発現変化を解析する。これらのトランスジェニックマウスとコントロールマウスにつき、水晶体の状態を経過観察し、水晶体混濁とOtx2発現の相関を解析する。混濁した水晶体は電子顕微鏡解析、タンパク質分析、遺伝子発現解析等を行い、水晶体上皮細胞・線維細胞の配列、細胞内のクリスタリン蛋白の状態、遺伝子発現の変化などを明らかにする。(2) 水晶体細胞特異的にOtx2をノックダウンするマウスを作成し、UV-B暴露により誘発される白内障が抑制されるかを明らかにする。上記の水晶体細胞特異的プロモーターの制御下に、3'非翻訳領域にOtx2 shRNA配列を挿入したGFP遺伝子、またはmiRNA部分をOtx2 shRNA配列に置き換えたmiRNA遺伝子、を連結したベクターを作成してマウス受精卵に導入し、水晶体特異的にOtx2 shRNAを発現するマウスを作成する。これらマウスに、UV-B誘起白内障モデルを適用し、白内障発症が抑制されるかを明らかにする。(3) UV-B照射によるOtx2発現亢進はUVBによる活性酸素（H2O2）生成を介していることが示されていることから、UV-B照射による白内障マウスモデルにおいて、抗酸化剤の投与でOtx2の発現が抑えられ、水晶体混濁が抑制されるかの検討を行う。Otx2アンチセンスDNAやsiRNAを白内障モデル動物の眼内に投与する手法の開発も試みる。(4)白内障手術後に発症する後発白内障にEMTの関与が示唆されていることから、後発白内障でのOtx2の発現動態を明らかにする。