DNA二本鎖切断を誘導し、口腔癌の原因となる歯周病菌と病原因子の特定

• Project/Area Number: 19K16647
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 49050:Bacteriology-related
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 手島 理絵 大分大学, 医学部, 客員研究員 (30816187)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
• Keywords: パルスフィールド電気泳動 / 好気性菌 / 感染時間 / 歯周病菌 / 口腔癌 / DNA double-surand beak

Outline of Research at the Start

歯周病が口腔癌のリスク要因であるとの報告がある。DNA損傷の蓄積、即ちゲノム不安定性は癌細胞の本質的な変化のひとつであり、慢性的な細菌感染によっても、宿主ゲノムDNA二本鎖切断(DSB)が誘導され、その蓄積が、発癌機構のひとつであることが示唆されている。よって、口腔内細菌叢の破綻が相乗的にゲノム不安定性に関与しているのではないかと推察できる。しかし、これまでに口腔内細菌がDSBを引き起こすかは明らかにされておらず、口腔内細菌叢の変化とそのゲノム不安定性についても詳細な検討はされていない。よって、歯周病菌が、実際にDSBを誘導するかどうかを明らかにすることを研究目的とし実験を進めていく。

Outline of Annual Research Achievements

1)歯周病原因菌のin vitro感染実験
歯周病原因菌のスクリーニングと解析
ATCCや他の研究機関で分離された菌株を入手し、SAS細胞に歯周病菌を感染させ、感染後24時間で感染細胞を回収し、パルスフィールド電気泳動を行い、DNAをEtBrにて染色し評価を行った。まず好気性菌である、Streptococcus anginosus、Streptococcus sanguinis （ATCC105576）、Streptococcus gordoni （ATCC10558）、Enterococcus faecalis （ATCC19433）、Streptococcus mutance(ATCC25175)について検討を行った。これらは好気性菌であり、細胞の培地内で急速に増加するため、MOIを小さくし感染を行ったが、いずれの細胞、いずれのMOI条件でも好気性の歯周病菌は培地内で急速に増加し、24時間以内に細胞が死んでしまった。よって感染時間の短縮を行ったが、12時間でも細胞は死滅。よって6時間後に細胞を回収し、PFGEを行ったが、DSBを示唆する所見は認めなかった。
次に嫌気性菌であるTreponama denticola（spirochaeta）、Polphyromonas gingivalisについて検討を行った。Treponama denticola　は増殖速度が遅いため、十分な量の菌が得られなかったことより、濃縮して感染を行ったが、パルスフィールド電気泳動ではDSBを示唆する所見は認めなかった。Polphyromonas gingivalisに関しては感染24時間後にパルスフィールドにてDSBを示す所見を認めたが、同条件で再度行ったところ、DSBを示す所見が認められず、再現性が得られなかった。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

Treponama denticola（spirochaeta）の培養が困難であり、培地、培養温度、培養時間の条件を変更し培養を試みたが、十分な量の菌を得ることが出来ず、Treponama denticolaをSAS細胞に感染させることができなかった。
好気性菌に関してはMOIを小さくして細胞に感染させても、細胞培地内で急激に増殖し、細胞が死んでしまうため、感染細胞を回収することができなかった。
SAS細胞にAggregatibacter actinomycetemcomitansを感染させた場合、感染24時間後から免疫蛍光染色にてDNA損傷を示すγH２AXが見られるようになり、DSBの蓄積を確認することができた。そして、パルスフィールドでも感染24時間後からDSBが確認できるようになっているため、DBSの蓄積は24時間後以降に認められる可能性があると思われる。よって好気性菌を6時間感染させるのでは感染時間が短いと考えられる。
Polphyromonas gingivalisに関しては実験結果に再現性が得られず、また、パルスフィールド電気泳動にてアポトーシスの誘導の可能性を示唆する所見も認めたため、評価が困難であった。

Strategy for Future Research Activity

好気性菌に関しては細菌感染では細胞が死んでしまうため、細菌培養上清の添加し、再度検討を行う予定である。
Polphyromonas gingivalisに関してはLPSやジンジパインなどの毒素を産生しているため、細菌培養上清の添加で再度検討を行い、アポトーシスの誘導の有無も確認する予定である。
大分大学の口腔癌患者の臨床検体を用いて、唾液、歯垢、組織のマイクロバイオームを調べた結果、非腫瘍組織と比較し、腫瘍組織内では主要な歯周病菌であるCapnocytophaga sputigena, Fusobacterium nucleatum, Treponema denticola が増殖しており、さらに、Porphytmonas gingivalis, Prevotella intermediaの2菌は健常者では検出されず、口腔癌患者のみから検出されたことが分かっていることより、Capnocytophaga sputigena, Prevotella intermediaに関しては菌株を入手し、DSB誘導能があるかを検討していきたい。