| Project/Area Number |
19K16647
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 49050:Bacteriology-related
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
手島 理絵 大分大学, 医学部, 客員研究員 (30816187)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
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| Keywords | パルスフィールド電気泳動 / 歯周病菌 / 好気性菌 / 嫌気性菌 / 上清 / 感染時間 / 口腔癌 / DNA double-surand beak |
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| Outline of Research at the Start |
歯周病が口腔癌のリスク要因であるとの報告がある。DNA損傷の蓄積、即ちゲノム不安定性は癌細胞の本質的な変化のひとつであり、慢性的な細菌感染によっても、宿主ゲノムDNA二本鎖切断(DSB)が誘導され、その蓄積が、発癌機構のひとつであることが示唆されている。よって、口腔内細菌叢の破綻が相乗的にゲノム不安定性に関与しているのではないかと推察できる。しかし、これまでに口腔内細菌がDSBを引き起こすかは明らかにされておらず、口腔内細菌叢の変化とそのゲノム不安定性についても詳細な検討はされていない。よって、歯周病菌が、実際にDSBを誘導するかどうかを明らかにすることを研究目的とし実験を進めていく。
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病原因菌のスクリーニングと解析
入手していたATCCや他の研究機関で分離された菌株を使用し、SAS細胞に歯周病菌や上清を感染させ、一定時間感染させた後、感染細胞を回収し、パルスフィールド電気泳動を行い、DNAをEtBrにて染色し評価を行った。
好気性菌である、Streptococcus anginosus、Streptococcus sanguinis （ATCC105576)、Streptococcus gordoni（ATCC10558）、Enterococcus faecalis（ATCC19433）、Streptococcus mutance(ATCC25175)について検討を行った。
これら好気性菌は細胞の培地内で急速に増加するため、MOIを小さくしても、24時間後には細胞が死滅してしまう。しかし、SAS細胞にAggregatibacter actinomycetemcomitansを感染させた実験結果より、DBSの蓄積には24時間以上の感染が必要であるため、液体培地で培養した上清を感染させることとした。1種類の菌の上清をSAS細胞に感染させ、24時間後に細胞を回収し、パルスフィールド電気泳動を行ったが、DSBを示唆する所見を得ることができなかった。口腔内では菌はバイオフィルムを形成し、相互作用により歯周病を発症しているため、1種類の菌のみの感染ではなく、複数の菌の上清をを混和させて感染を試みたが、DBSを示唆する所見は認めなかった。
Treponama denticola（spirochaeta）の培養が困難であり、十分な量の菌を得ることが出来なかったため、菌を濃縮させ、好気下、嫌気下でSAS細胞への感染を試みたが、DBSを示唆する所見は得られなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
コロナの感染による体調不良により、実験に十分な時間を費やすことが困難となったことが主な理由である。
Treponama denticola（spirochaeta）の培養が困難であるため、昨年と同様、培地、培養温度、培養時間の条件を変更し培養を試みたが、十分な量の菌を得ることが出来なかった。少量ではあるが培養はできていたため、濃縮して感染を試みたが、DBSを示唆する所見は得られなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回行った条件ではTreponama denticola（spirochaeta）の感染によりDBSは蓄積されないと考えられるため、Treponama denticola）を使用する実験は終了し、他の菌を使用することとする。
キーストーンとしても知られているPorphytmonas gingivalisを他の好気性菌の上清と組み合わせて感染させたが、DBSの蓄積は確認できていない。同じ歯周病菌で嫌気性菌のFusobacterium nucleatumは過去に感染実験を行っており、DBSは蓄積されなかったが、Porphytmonas gingivalisの生育に影響を及ぼし、歯周病の病変部のデンタルプラークからPorphytmonas gingivalisと共にFusobacterium nucleatumも高頻度で検出されているという報告もあるため、現在はこの２種の菌を混和して感染実験を行っている。
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