免疫記憶の制御をターゲットとした、免疫抑制に対する新規アプローチ法の開発研究

Research Project

Project/Area Number	19K22646
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 55:Surgery of the organs maintaining homeostasis and related fields
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	植木伸也北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (30837258)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	後藤了一北海道大学, 大学病院, 助教 (10645287) 財津雅昭北海道大学, 医学研究院, 客員研究員 (20768981) 渡辺正明北海道大学, 医学研究院, 特任講師 (40789848)
Project Period (FY)	2019-06-28 – 2022-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2019)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2020: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywords	記憶T細胞 / マウス心移植 / 免疫寛容 / CD3抗体 / 臓器移植 / 免疫記憶
Outline of Research at the Start	本研究は、免疫記憶を原因とする拒絶反応の選択的制御による免疫抑制の個別化を目的としている。現状の免疫抑制では免疫記憶の制御と免疫寛容の誘導との両立は非常に困難である。近年、ATP受容体であるP2X7Rの阻害により免疫記憶の主体であるmemory T細胞を選択的に抑制できる可能性が指摘されている。本研究ではマウス心移植系を用いて、P2X7Rの阻害によるmemory T細胞の選択的阻害効果と拒絶に対する影響についての基礎的検討を行う。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は選択的なmemory T 細胞に対する治療法を開発することで、臨床で問題となる免疫記憶による抵抗難治性の免疫寛容不成立症例や、慢性拒絶反応に対する治療法を開発しようとするものである。最初に、本研究に必要なマウス心移植モデルが現行の施設においても問題なく実施可能であるか検討した。C57BL6 (B6)またはBALB/cマウスをドナーとし、B6マウスをレシピエントとした場合、Syngenicにおいては拒絶されずに100日以上の長期生存が得られ、allogenicにおいては移植後7-8日で拒絶反応により心グラフトの拍動が停止することが確認された（n=5）。続いて研究分担者である後藤らにおいて報告(Am J Transplant 2012)されたFc非結合型抗CD3e抗体を用いた免疫寛容誘導プロトコールが、このマウスの系統においても成り立つかどうかについて確認した。現在観察期間中であるが、免疫寛容が誘導されるFc非結合型抗CD3e抗体の遅延投与群において長期のグラフト生存が得られそうである(n=4, 現在最長で60日)。一方でBALB/cの心グラフトを移植したB6マウスの脾臓からリンパ球を抽出し、これをnaiveのB6に移入、同系統の心移植を実施することで、記憶細胞存在下での心移植のグラフト生存期間を確認する予定である。このためにBALB/cの心グラフト移植した感作済みのマウスを作成済みである。このモデルにおいて感作されたリンパ球を移入した場合、グラフト生存期間が短縮するようであれば、続けてFc非結合型抗CD3e抗体の遅延投与群のグラフト生存延長効果を検討する。またこのモデルにおいて移入したアロ抗原特異的な記憶細胞を追跡するためにコンジェニックマウスであるB6-Ly5.1を購入、繁殖を計画し、施設に申請中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason マウスの心移植モデルの確立とFc非結合型抗CD3e抗体を静脈内にi.v.投与する手技の確立に時間を要したが、モデルの確立により今後は計画通りに進行できるものを考えられる。しかし、TCR-Tgマウスの購入、繁殖の前にWildマウスで実験の方向性を確認する必要があり、その後のTCR-Tgマウスの導入となるとやや時間を要す可能性がある。In vivoで確認すべき実験はある程度の観察期間を必要とするので、in vivoとin vitroの実験を組み合わせつつ進める予定である。
Strategy for Future Research Activity	研究実績の概要にも記載したが、memory T細胞を移入した場合に免疫寛容プロトコールが成立しないことを確認し、このmemory T細胞をターゲットとした治療P2X7R阻害により免疫寛容誘導プロトコールが可能になることを示す予定である。しかし、最近の研究報告では感作していないマウスにおいて最初にグラフトに浸潤する細胞は記憶細胞の表現型であり(Schenk A et al., Am J Transplant, 2008)、記憶細胞の中でもグラフト攻撃性を持つ細胞のみを選別して制御することが重要である可能性がある。即ち記憶細胞全てを抑制した場合、当初の計画で選択的にその効果を残したい制御性T細胞も含めて抑制してしまう可能性がある。そのためにもP2X7Rの発現がグラフト攻撃的な細胞のみ発現するのか確認する必要がある。その方法として移入する細胞を表現型によってsortし、いずれの細胞がグラフト攻撃性を持つのかを同定、その細胞集団がP2X7Rを発現するかどうかを確認する。そのために必要であればOva-expressingマウスやOT-1またはOT-IIマウスを購入、繁殖し、抗原特異的な細胞の同定とその発現型を確定する。