Project/Area Number |
19K22756
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Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Medium-sized Section 58:Society medicine, nursing, and related fields
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Research Institution | Nagoya University |
Principal Investigator |
石井 晃 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (30252175)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
名取 雄人 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (80610104)
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Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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Keywords | 法医学 / 法医鑑定 / 法医生化学 / ペプチド分析 / 質量分析 / 死後診断 / ミオグロビン / プロテオミクス |
Outline of Research at the Start |
本研究においては、ペプチド質量分析に習熟した研究協力者と共に、最新の質量分析技術を駆使して、熱中症等で上昇する尿中ミオグロビン、頸部圧迫で上昇する可能性がある血液中サイログロブリン、心不全のマーカーである血液中NT-proBNPなどについて、分解したペプチドをターゲットとした同定・定量法を確立する。同時に、死後変動の再検討も行い、死後経過時間の長い死体におけるこれらタンパク及び分解ペプチドマーカーの高感度かつ正確な同定・定量を試みる。最終的には、法医鑑定に資する体液中分解ペプチドマーカーを確立する。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生体試料における目的タンパクの定量法を開発し、次いで、実検体で切断されているペプチドフラグメントを同定し、法医診断に資するタンパク(ペプチド)マーカーの探索を行うことを目的とする。対象となるタンパクとしては、熱中症で上昇するミオグロビン、心不全で上昇するNT-proBNPが挙げられる。 本年度は、昨年度に引き続き、標準尿サンプルからのミオグロビンの検出条件について検討した。法医鑑定においては、多くのサンプルが腐敗変性の影響を受けていることを考慮し、腐敗尿におけるミオグロビンの挙動を検討した。サンプルは4種類とし、新鮮尿、新鮮尿を濾過滅菌したもの、37度で1週間放置した腐敗尿、この腐敗尿を濾過滅菌したものである。タンパク沈殿により得られたミオグロビン(チューブあたり20 ng)にこれら尿サンプル40 microLを加えて溶解し、37度のドライオーブンにて1週間放置した。上記の試料40 microLに電気泳動用サンプルバッファーを13 microL添加し、95度5分間加熱変性後、電気泳動を施行し、ウェスタンブロッティングを行った。メンブレンを、1000倍希釈抗ヒトミオグロビン Ig G(ウサギ)と2000倍希釈抗ウサギ Ig Gに結合させた後、ExWestLumi plus (ATTO)で発色させ、ChemidocMPでバンドの検出を行った。すると、いずれの試料においてもミオグロビンのバンドは検出されなかった。これは、新鮮尿、腐敗尿のいずれにおいても、37度1週間放置ではミオグロビンが分解されると考えられ、その原因としては、細菌による分解というよりも、尿中のプロテアーゼなどによる分解や、尿中分子との結合が想定されるが、総合的には、尿中の分子による分解が考えやすい。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度も、コロナ禍による登校制限などの要因が重なり、十分な実験検討が行えなかったため。
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Strategy for Future Research Activity |
今回の実験では、新鮮尿にも含まれる尿中の分子、特にプロテアーゼが尿中ミオグロビンを分解しており、細菌の関与は少ないと想定された。したがって、今後、タンパクによる酵素的分解が主であることの証明、ついで分解のタイムコースと検出されうるミオグロビン濃度を産出し、さらなる条件検討を進める予定である。
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