Interaction of sperm protease with egg extracellular matrix and its application to reproduction technology

• Project/Area Number: 20H02949
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38060:Applied molecular and cellular biology-related
• Research Institution: Fukushima University
• Principal Investigator: 松田 幹 福島大学, 食農学類, 教授 (20144131)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西尾 俊亮 福島大学, 食農学類附属発酵醸造研究所, 特任助教 (20825880) ; 宮田 真路 東京農工大学, 農学部, 准教授 (60533792) ; 大島 健司 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (90391888)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥13,650,000 (Direct Cost: ¥10,500,000、Indirect Cost: ¥3,150,000); Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000); Fiscal Year 2022: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2021: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2020: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: 受精 / 精子プロテアーゼ / アクロシン / 卵透明帯 / ZPタンパク質 / 透明帯 / 細胞外マトリクス / 卵細胞外マトリクス

Outline of Research at the Start

哺乳類の卵子の周囲は卵固有の組織層（透明帯: ZPとよばれる）で被覆されている。受精の最初の段階で精子がZPに結合し活性化された後、精子頭部の小胞プロテアーゼの一部が遊離してZP構成タンパク質を分解し、ZPの網目に隙間を形成して精子のZPの貫通と卵細胞への結合を可能にする。異なる組み合わせのZP構成タンパク質（ZP1-4）を持つ数種の哺乳類を研究対象として精子プロテアーゼによるZPタンパク質の結合と分解、さらにZP溶解の分子機構を解明する。異なるZPタンパク質がどのようにZPを形成し、それに対応して精子プロテアーゼがどのように共進化して受精機能を維持してきたかを明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題は、哺乳類卵子の透明帯構成ZPタンパク質と精子プロテアーゼ、アクロシンとの特異的相互作用の解明を目指しており、特に受精時に精子が卵透明帯を貫通する際に透明帯構成成分であるZPタンパク質を限定分解して透明帯マトリクスを溶解させる機構の解明を目指している。
昨年度までの研究により、動物細胞で分泌発現させたアクロシンとZPタンパク質（ZP1-ZP4）を細胞内で同時に発現させて反応させることでブタアクロシンによって、ブタZPタンパク質が断片化することを明らかにしてきた。今年度はこれまでに確立した哺乳類アクロシンとZPタンパク質の動物細胞分泌発現システムを使って、「精子アクロシンは卵透明帯ZPタンパク質を種特異的に断片化するか？」という基本的な問いに対する答えを得ることを目指して研究進めた。
これまでに合成基質でのアッセイで高いプロテアーゼ活性を示したブタアクロシンを用いてブタZPタンパク質の分解を解析してきたが、種間での違いを比較解析するために、ヒトのアクロシンとZPタンパク質の実験系を用いて同様に分泌発現と断片化を調べた。ヒトのアクロシンは合成基質でのアッセイではブタよりも活性が低い結果が得られているが、ZPタンパク質を基質にした場合の活性は明らかでなかった。そこで、ヒトのアクロシンを動物細胞で分泌発現させて、同様に分泌発現させたヒトZPタンパク質を用いて解析し、ヒトアクロシンがヒトZPタンパク質の特定の部位で切断することを明らかにした。ZPタンパク質断片化はブタの系での断片化よりも顕著であった。合成基質を用いた際のプロテアーゼ活性とは必ずしも一致しない、という興味深い結果となった。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Presentation] 3D architecture of the vertebrate egg coat and structural basis of the ZP2 block to polyspermy (2023)
  • Author(s): Nishio S, Emori C, Wiseman B, Fahrenkamp D, Dioguardi D, Zamora-Caballero S, Bokhove M, Han L, Stsiapanava A, Lu Y, Kodani M, Matsuda T, Bainbridge RE, Komondor KM, Carlson AE, Landreh M, de Sanctis D, Yasumasu S, Ikawa M and Luca Jovine L
  • Organizer: the Gordon Research Conference on Fertilization and Activation of Developmen
  • Int'l Joint Research / Invited