| Project/Area Number |
20K05797
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Fukuyama University |
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Principal Investigator |
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2022: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2021: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 枯草菌 / タンパク質発現 / フラボノイド / ラムノース / ペクチン / T7 RNAポリメラーゼ / 細菌フェロモン / 誘導物質 |
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| Outline of Research at the Start |
枯草菌はヒトや動物に有害となる物質を含まないため、目的タンパク質を有害物質フリーで生産する際の宿主として適しているが、大腸菌宿主系よりも発現誘導物質が制限されること、発現量が少ないことが弱点である。本研究では、枯草菌でラムノース、フラボノイド、および細菌フェロモンといった低毒性物質で誘導されるタンパク質高発現系を構築し、安全かつ高効率のタンパク質生産技術を開発する。ラムノース誘導系は誘導物質の取り扱いやすさと誘導特異性、フラボノイド誘導系は誘導物質の細胞膜透過能と別の細菌宿主への転用の可能性、細菌フェロモン誘導系は細胞密度に応じた発現誘導というように各々が産業利用する上で有用な特徴をもつ。
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| Outline of Final Research Achievements |
Protein expression systems inducible by low-toxicity substances were developed in Bacillus subtilis. The fusion of a flavonoid-responsive promoter (PqdoI) with the T7 RNA polymerase gene (T7 pol) was integrated into the chromosome, and a plasmid carrying the target gene under the control of the T7 promoter was introduced to create a flavonoid-inducible T7 expression system. Improving the PqdoI responsible for T7 pol control enhanced the expression level upon induction.
T7 expression systems inducible sugars, such as rhamnose and pectin, were attempted to create by replacing the T7 pol control region with promoters responsive to those sugars. In the pectin-inducible system, induction required a long time, while in the rhamnose-inducible system, considerable expression leakage was observed even under the non-inducing condition.
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| Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements |
枯草菌は哺乳類に対して非病原性であり、本研究で用いたいずれの誘導物質も哺乳類への毒性が低いので、当該T7発現系によって目的タンパク質の有害物質フリーでの獲得が容易となる。フラボノイド誘導型発現系では、厳密な発現制御と高発現量を両立できており、目的タンパク質が宿主細胞の増殖に悪影響を及ぼす場合に有用となる。アグリコン形態のフラボノイドは疎水性が高いので、特定の輸送体を介さずに膜透過で細胞内に取り込み可能である。したがって、当該発現系の他の細菌宿主への移行が比較的容易であると考えられる。誘導物質の１つであるケルセチンが安価なこともこの発現系の産業利用の可能性を高めている。
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