Project/Area Number |
20K16950
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Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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Research Institution | Yamagata University |
Principal Investigator |
角田 道彦 山形大学, 医学部, 客員研究員 (30838420)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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Keywords | 膵癌 / オルガノイド / Extra cellular vesicles / organoid |
Outline of Research at the Start |
ヒト膵癌由来の病理検体・切除検体を用いて三次元環境下での培養、さらに共培養を用いる事で生体内により近い環境での癌細胞培養を行う。膵癌の各進行度の組織細胞につき培養し検体量を確保した上で、次世代シークエンサーによる癌遺伝子パネル・コピー数多型解析・マッピングを行う。さらにEV内包RNAを各培養細胞より抽出、シークエンスによる解析を行うことで、膵癌早期診断に有用なマーカー同定を行う。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、超音波内視鏡ガイド下穿刺生検(EUS-FNA)検体由来の膵癌organoidを用いて遺伝子解析を行い、膵癌進行度に特異的な遺伝子変異を呈するのか、また得られた膵癌細胞と膵間葉系細胞との共培養によりorganoidを構築し、培地から回収したEV由来のmiRNAの発現に影響を与えるかを目的としている。
EUS-FNA検体から膵癌organoidの樹立は安定的に行う事が可能であるが、検体採取量にも依存するため、樹立効率は68%であった。樹立した18検体の膵癌organoidと膵切除検体から樹立した正常膵管上皮organoid2検体の中から、正常膵管上皮organoid1検体と、膵癌organoid3検体を選択肢、初代培養と10継代培養したorganoid間で遺伝子変異が維持されるかを確認するために、comprehensive cancer panelで代表的な癌遺伝子について変異解析を行った。膵癌organoid3検体については、継代を経てもKRAS変異および他の癌遺伝子変異を安定的に保持する事が確認され、正常膵管上皮organoidでは膵癌に特徴的に発現する癌遺伝子変異を認めない事を確認した。
organoid培地から回収した培地から超遠心機で既報のプロトコールと同様に遠心し、EVを回収した。NanoSightでEVの大きさと数の評価を行い、平均して1.0×1E6/ml個が2mlの培地から得られた。RNeasy Midi kit (QIAGEN)を用いて培地からexsosomal RNAを抽出し、Bioanalyser (Agilent)でsmall RNAの質的評価を行い、1.8-5.0 ng/ulのsmall RNAが抽出可能であった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
EUS-FNA由来の膵癌organoidの樹立効率が6割台であり、検体によっては継代がうまく進まない株が存在する事が分かった。よって、まず安定して継代可能な株を樹立する事と、継代による形質変化(新たな変異の蓄積)がないかを確認する必要があると判断し、CCPで初代培養株と10継代後の株で変異解析を行う事を優先したため、実験の進捗が遅延している。
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Strategy for Future Research Activity |
organoidと星細胞の共培養の安定化に時間がかかる事が予想されたため、培地からのEV抽出、exosomal RNAの抽出を優先的に進めており、現在small RNA sequenceの準備段階である。
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