Visualization of the intracellular dynamics of artificial mRNAs

• Project/Area Number: 20K22704
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: 0801:Pharmaceutical sciences and related fields
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: Hiraoka Haruka 名古屋大学, 理学研究科, 研究員 (70880053)
• Project Period (FY): 2020-09-11 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 化学修飾核酸 / RNAイメージング / 翻訳 / 細胞デリバリー / mRNA医薬 / 修飾核酸 / 核酸デリバリー / 核酸医薬 / mRNA / 細胞内ダイナミクス / イメージング

Outline of Research at the Start

人工mRNAの細胞内導入により正常なタンパク質の生成を促すmRNA医薬が次世代医薬品として注目される一方で、しかし未だ実用化には至っていない。
実用化に向けたmRNA構造の改良を推進するため、本研究では外来mRNAの細胞内導入からタンパク質生成に至る機構を可視化する技術の開発を目指した。
可視化に伴う細胞への負担を最小限にするために、所属研究室で開発中の細胞膜透過性を与える分子修飾を利用して、イメージング用プローブの穏やかな細胞内導入を試みる。

Outline of Final Research Achievements

In this research theme, I tried to develop the RNA imaging method using fluorescence nucleic acid probe. The nucleic acid probe used for bacteria in previous research could not be used in human cells as such short oligonucleotide easily permeated into nuclei and rarely bound with target mRNA in cytosol. Therefore, instead of using the nucleic acid probe, I currently deal with the development of fluorescence mRNA composed with fluorescence nucleotides. I also achieved the intracellular delivery of the nucleic acid probe by chemical modification. Previously developed membrane-permeable oligonucleotide including 5 repeats of disulfide modification units has limited use due to their high hydrophobicity. This study reported circular disulfide group as promising modification; it enables the efficient intracellular delivery with smaller number of units.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

RNAイメージングに用いる蛍光核酸プローブをダメージなく細胞に導入するために最適な化学修飾の探索を行った結果、環状ジスルフィド修飾を付加することで細胞毒性なく効果的に細胞導入できることが分かった。従来の膜透過性核酸よりも少ない修飾ユニット数で細胞膜透過を実現しており、疎水性も遥かに低い。その優れた物性から、蛍光前駆体など他の修飾基との併用や、1000塩基を超える長いmRNAの導入への適用など高い汎用性が期待される。また、本手法はエンドサイトーシス等を介さず直接的に細胞質へと導入できる。この技術を用いて、蛍光mRNAの導入から翻訳に至る過程を経時的に観察することを目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Murdoch University(オーストラリア)
• [Journal Article] Antisense Oligonucleotide Modified with Disulfide Units Induces Efficient Exon Skipping in mdx Myotubes through Enhanced Membrane Permeability and Nucleus Internalization (2021)
  • Author(s): Haruka Hiraoka, Zhaoma Shu, Bao Tri Le, Keiko Masuda, Kosuke Nakamoto, Lyu Fangjie, Naoko Abe, Fumitaka Hashiya, Yasuaki Kimura, Yoshihiro Shimizu, Rakesh N Veedu, Hiroshi Abe
  • Journal Title: ChemBioChem Volume: 22(24) Issue: 24 Pages: 3437-3442
  • DOI: 10.1002/cbic.202100413
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 膜透過性核酸MPONは効率的に核移行しエキソンスキッピングを促進する (2022)
  • Author(s): 平岡陽花, Zhaoma Shu, Bao Tri Le, 益田恵子, 中本航介, 林光太朗, 阿部奈保子, 木村康明, Rakesh N. Veedu, 清水義宏, 内田智士, 阿部洋
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] 化学修飾mRNAの合成及びその細胞膜透過性と翻訳能の検討 (2022)
  • Author(s): 杉山里美, 平岡陽花, 中嶋裕子, 阿部奈保子, Zhenmin Li, 加藤駿一, 吉田祐希, 加瀬光希弥, 阿部洋
  • Organizer: 日本化学会第102春季年会
• [Presentation] 核酸医薬送達プラットフォームとしての細胞膜直接透過型オリゴ核酸 (2022)
  • Author(s): 秤谷隼世, 平岡陽花, Shu Zhaoma, 松原徳明, Lyu Fangjie, 稲垣雅人, Zhenmin Li, Steve Soo, 木村康明, 阿部洋
  • Organizer: 日本薬学会第142年会
• [Presentation] Development of new membrane permeable oligonucleotides for therapeutic (2021)
  • Author(s): Lyu Fangjie, 平岡陽花, Shu Zhaoma, 川口紗貴, 中本航介, 益田恵子, 林光太朗, 阿部奈保子, 木村康明, 清水義宏, 内田智士, 阿部洋
  • Organizer: 第15回 ケミカルバイオロジー学会
• [Presentation] 自発的かつ超高速に細胞内に導入される膜透過性核酸MPONの開発 (2021)
  • Author(s): 平岡陽花, Shu Zhaoma, 川口紗貴, 中本航介, 益田恵子, 林光太朗, 阿部奈保子, 木村康明, 清水義宏, 内田智士, 阿部洋
  • Organizer: 日本核酸医薬学会 第6回年会
• [Presentation] ジスルフィド結合を利用した細胞膜透過性オリゴ核酸の開発 (2021)
  • Author(s): 松原徳明, 平岡陽花, Shu Zhaoma, 川口紗貴, 中本航介, 益田恵子, 林光太朗, 阿部奈保子, 木村康明, 清水義宏, 内田智士, 阿部洋
  • Organizer: 日本核酸医薬学会 第6回年会
• [Presentation] 自発的かつ超高速に細胞内に導入される膜透過性核酸MPONの開発 (2021)
  • Author(s): 平岡陽花, Shu Zhaoma, 川口紗貴, 中本航介, 益田恵子, 阿部奈保子, 木村康明, 清水義宏, 阿部洋
  • Organizer: 第37回 日本DDS学会学術集会
• [Presentation] 化学修飾mRNAの合成及びその細胞膜透過性と翻訳能の検討 (2021)
  • Author(s): 杉山里美, 平岡陽花, 阿部奈保子, 中嶋裕子, 吉田祐希, 加瀬光希弥, 野村浩平, 阿部洋
  • Organizer: 第37回 日本DDS学会学術集会
• [Presentation] Membrane permeable oligonucleotide (MPON) induce the exon skipping against pre-mRNA by the enhanced transfer of antisense DNA to nucleus (2021)
  • Author(s): Haruka Hiraoka, Shu Zhaoma, Saki Kawaguchi, Kosuke Nakamoto, Keiko Masuda , Kotaro Hayashi, Naoko Abe, Yasuaki Kimura, Yoshihiro Shimizu, Satoshi Uchida, Hiroshi Abe
  • Organizer: 第22回 日本RNA学会年会
• [Presentation] 自発的かつ超高速に細胞内に導入される膜透過性核酸MPONの開発 (2021)
  • Author(s): 平岡陽花, Shu Zhaoma, 川口紗貴, 中本航介, 益田恵子, 阿部奈保子, 木村康明, 清水義宏, 阿部洋
  • Organizer: 日本薬学会 第141回年会
• [Presentation] 細胞膜透過性核酸(MPON)の開発 (2020)
  • Author(s): 川口紗貴, 中本航介, 平岡陽花, 星和明, 阿部奈保子, 木村康明, 阿部洋
  • Organizer: 第36回 日本DDS学会学術集会
• [Presentation] 細胞膜透過性核酸(MPON)の開発 (2020)
  • Author(s): 川口紗貴, Zhaoma Shu, 中本航介, 平岡陽花, 星和明, 阿部奈保子, 木村康明, 阿部洋
  • Organizer: 第14回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] 自発的に細胞内に導入される膜透過性核酸MPONの開発 (2020)
  • Author(s): 平岡陽花, Shu Zhaoma, 川口紗貴, 中本航介, 益田恵子, 阿部奈保子, 木村康明, 清水義宏, 阿部洋
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会
• [Presentation] 自発的に細胞内に導入される膜透過性核酸MPONの開発 (2020)
  • Author(s): 平岡陽花, Shu Zhaoma, 川口紗貴, 中本航介, 益田恵子, 阿部奈保子, 木村康明, 清水義宏, 阿部洋
  • Organizer: 第11回「光塾」