Acquisition mechanism of brain-specific properties for regulatory T cells in central nervous system diseases
| Project/Area Number |
21K06951
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49030:Experimental pathology-related
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| Research Institution | Juntendo University (2022)
Keio University (2021) |
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Principal Investigator |
山本 伸一 順天堂大学, 健康総合科学先端研究機構, 非常勤助教 (10634800)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 制御性T細胞（Treg） / 組織Treg / アストロサイト / 脳 / 神経疾患 / Treg / ミクログリア / 制御性T細胞 / グリア / 中枢神経系疾患 / 脳Treg |
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| Outline of Research at the Start |
近年ではアルツハイマー病やパーキンソン病をはじめとする様々な神経疾患と免疫系の関連性が報告されており、中枢神経系疾患における免疫系との関与が明らかになりつつあるが、不明な点が多く残されている。
また、中枢神経系において、炎症や免疫応答の制御に重要な脳特異的制御性T細胞（脳Treg）の存在が明らかとなり、脳Tregによる神経系炎症制御の理解は、中枢神経系疾患の治療・予防法の開発に重要な課題である。
そこで本研究では、脳炎症後に脳内に浸潤するTregの脳特異的発現獲得メカニズムを解明し、脳内炎症性疾患の制御と脳組織修復を促すことで、多種多様な神経疾患増悪化のTregによる制御法開発が期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
制御性T細胞（Treg）は、中枢神経系、皮膚、消化管、内臓脂肪組織などの非リンパ組織の恒常性と再生を促進することにより、組織耐性維持に不可欠な機能を果たすことが示されている。そして、これらの非リンパ組織Tregは、炎症性サイトカインIL-18やIL-33などの因子を介して、その場で組織損傷を感知することにより、TCRシグナル伝達とは無関係に組織修復を促進すると考えられている。さらに近年ではアルツハイマー病やパーキンソン病をはじめとする様々な神経疾患と免疫系の関連性が報告されており、中枢神経系疾患における免疫系との関与が明らかになりつつあるが、不明な点が多く残されている。本研究の目的は、脳炎症後に脳内浸潤する脳Tregが、脳環境に応じて脳特異的遺伝子発現の獲得メカニズムを解明し、脳内炎症性疾患の制御と脳組織修復を促すことである。そこで本研究では、脾臓とリンパ節から得られたナイーブTregは、初代培養アストロサイトの存在下で活性化され、T細胞受容体（TCR）刺激によって増殖された。さらに、インターロイキン33（IL-33）とセロトニンを追加するとST2（IL-33受容体）、ペルオシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）およびセロトニン受容体7（HTR7）などの脳Tregで見られる発現の一部が誘導された。また、トランスクリプトーム解析より、in vivoにおける脳Tregと同一ではないが、同様の遺伝子発現パターンを示したことから、in vitroで脳Tregに近い誘導が可能であることが明らかとなった。さらに、T細胞が関与することが示されているパーキンソン病モデルにおいて、脾臓やリンパ節Tregよりもin vitroで誘導された脳Tregは脳内への浸潤が見られ、病理学的にも改善された。これらの結果より、脳Tregの理解と炎症性脳疾患の治療開発に貢献できる可能性が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
脳Treg誘導メカニズムを解明するために、制御性T細胞（Treg）と初代培養アストロサイトとの共培養系を確立した。まずTregは脾臓とリンパ節から取り出し、アストロサイトは、マウス新生仔脳から初代分離培養したものを使用した。また、他の培養系としてミクログリア単独培養、アストロサイトとミクログリアの混合培養や成熟脳切片を用いたスライスカルチャーとの比較検討も行なった。その中で、ナイーブTregはアストロサイトのみが存在する培養法で活性化される事が明らかとなった。さらに様々な生理活性因子でTregとアストロサイトを共培養すると、特にインターロイキン33（IL-33）とセロトニンを加えることで顕著なTregの増殖活性が見られた。その他にも組織Treg関連タンパク質である関連タンパク質の発現（ST2（IL-33受容体）など）が上昇し、Il1rl1（Interleukin 1 receptor like 1）やPparγ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）などの組織Treg共通遺伝子や脳Treg特異的マーカーであるHtr7（5-Hydroxytryptamine Receptor 7）の誘導を見出した。しかしながら、完全な脳Tregへの誘導は見られなかったが、抹消Tregとは異なる性質を獲得していた。次に、これらの誘導において細胞間の接着性と非接着性をトランスウェルまたはアストロサイトコンディションメディウム（ACM）を用いて解析したところ、これらの脳Tregへの誘導にはアストロサイトとの接着性が必要である事が示唆された。次にin vitroで作製した脳Tregを病態モデルマウスに移入することによって、in vivoでの脳内への浸潤と神経症状改善効果を検討した。まず、CD3欠損マウスの脳梗塞モデルに移入すると脾臓やリンパ節Tregよりも脳内への浸潤が見られ、さらにパーキンソン病モデルや多発性硬化症モデル（EAE）でも同様に脳内への浸潤と症状を改善させることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、脳特異的Tregの誘導機構を解明することで、新しい中枢神経系炎症性疾患の治療・予防法の確立を目指す。そのために、今後の推進方策として以下の諸点を遂行する。
（１）脳Treg誘導メカニズムの解明：本諸点においては、現在までに明らかになった誘導因子に対する抗体や阻害剤を用いて、脳Tregの誘導効果が抑制されるかどうかを確認する。さらに上流のみでなく下流シグナル経路においても同様に脳Tregに近い特徴を有するかを検討する。
（２）脳Treg誘導因子やin vitro誘導脳Tregによるin vivoでの脳内炎症制御：in vitroで誘導した脳Tregをパーキンソン病モデルや多発性硬化症モデル（EAE）に移入することで神経症状改善効果が明らかとなった。今後は（１）で同定した誘導因子や発現を高める薬剤を脳内投与することによって、脳内炎症性疾患後の組織修復意義についての検証を行う。また、誘導因子欠損マウスや阻害剤を用いて、脳Tregの誘導が抑制されるかどうかも確認し、パーキンソン病やEAEだけでなく脳梗塞モデルで共通性を検証する。
（３）脳内抗原の同定と抗原特異的Tregの誘導：脳Tregは脳内抗原を認識して保護効果を発揮していると推測される。そこで、①TCRをクローニングしてTCRAとTCRBを欠損するT cell hybridomaに遺伝子導入し、脳破砕物と共培養した際のIL-2を測定することで脳抗原に応答するTCRを絞り込む。②得られたTCRcDNAをレトロウイルスによってTregや通常のT細胞に発現させ、T細胞欠損マウスに移入してレトロジェニックマウスを作製し脳内浸潤を確かめる。③脳内抗原を同定するために、脳組織を破砕した組織抽出液を含むメディウム内で抗原提示細胞とTCR導入Tregを共培養し、ペプチドライブラリーによりエピトープを決定する。④(１)で同定した誘導因子を作用させて、in vitroで脳抗原特異的な脳Tregを作製する。
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Report
(2 results)
Research Products
(4 results)
