フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞の１粒子解析
| Project/Area Number |
21K07173
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
吉田 孟史 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任助教 (60635100)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 細胞外小胞 / ホスファチジルセリン / フローサイトメトリー / リキッドバイオプシー |
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| Outline of Research at the Start |
生体内のほとんどの細胞が分泌する直径30-150 nmの細胞外小胞（sEV）は、がんや神経変性疾患など様々な疾患への関与が明らかとなりつつある。しかしながら、非常に小さな粒子であるsEVを１粒子レベルで検出・解析することは困難であり、疾患診断への応用や基礎研究の発展が遅れている。フローサイトメトリーは、細胞に発現する複数のタンパク質を一細胞毎に検出可能であるが、ナノサイズのsEV検出への応用は確立されていない。本研究は、高純度sEV精製技術や高感度sEV検出技術を組合わせることでフローサイトメーターを用いたsEV解析技術を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞が分泌する直径30-150 nmの細胞外小胞（sEV）は細胞間情報伝達や代謝物の排出を行っており、様々な疾患の進行に関わっていることからsEVの検出による疾患診断法の確立が期待されている。疾患の早期診断や正確診断のためにはレアポピュレーションの検出と複数分子の検出に優位性があるフローサイトメーターを利用した一粒子解析が有用と考えられる。本研究では、フローサイトメーターを用いたsEV表面タンパク質、脂質、sEV内包microRNA（miRNA）解析技術を確立し、がん診断法に資する解析法の確立を目指す。これまでに１粒子解析が可能であるかの検証、タンパク質染色法の確立、脂質染色法の確立を完了しており、2022年度は定量解析法の確立、多様な細胞での解析を実施した。定量解析法の確立は、フローサイトメーターNanoFCMを用いて標準ビーズを用いた補正によるsEV粒子数の算出をおこなった。NanoFCMで得られた粒子濃度はNTA法で得られた粒子濃度と比較したところ、NanoFCMの方が若干高い粒子濃度を示す傾向にあった。これはNanoFCMが微小な粒子まで検出可能であることによると考えられる。多様な細胞での解析では、これまで使用してきた293T細胞由来sEVだけでなく、異なる口腔がん患者由来細胞OSC-20、HOC313、OSC-19細胞が分泌したsEVのPD-L1発現量を解析した。その結果、OSC-19細胞のsEVはPD-L1陽性sEVが約5%存在したが、その他の細胞のsEVではPD-L1陽性sEVは2%以下であった。以上のように、フローサイトメーターを用いたsEV解析に必要な、sEV上のタンパク質、脂質の定性解析および粒子数の定量解析が可能となり、多様な細胞が分泌するsEVを定性的に解析可能となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
フローサイトメトリ―を用いたsEVの解析に必要な定性解析法、定量解析法を確立した。さらに、多様ながん細胞が分泌するsEVの定性解析を実施し、がん細胞sEVの性質の違いを明らかにした。本研究は、当初の予定通りおおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、フローサイトメーターを用いたsEV解析に必要なsEV上のタンパク質、脂質の定性解析および粒子数の定量解析が可能となった。確立したsEV解析技術を用いて多様な細胞が分泌するsEVの定性的な解析を実施し興味深い知見を得ている。最終年度は、血液などのクルードな試料に含まれるsEVの解析を想定して、高純度sEV精製法の重要性について評価を実施する予定である。また、これらの成果を学術論文として発表することを目指す。
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Report
(2 results)
Research Products
(14 results)
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[Journal Article] Nanoscopic Assessment of Anti-SARS-CoV-2 Spike Neutralizing Antibody Using High-Speed AFM.2023
Author(s)
Keesiang Lim, Goro Nishide, Elma Sakinatus Sajidah, Tomoyoshi Yamano, Yujia Qiu, Takeshi Yoshida, Akiko Kobayashi, Masaharu Hazawa, Toshio Ando, Rikinari Hanayama, Richard W Wong
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Journal Title
Nano letters
Volume: 23
Issue: 2
Pages: 619-628
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Spatiotemporal tracking of small extracellular vesicle nanotopology in response to physicochemical stresses revealed by HS-AFM.2022
Author(s)
Elma Sakinatus Sajidah, Keesiang Lim, Tomoyoshi Yamano, Goro Nishide, Yujia Qiu, Takeshi Yoshida, Hanbo Wang, Akiko Kobayashi, Masaharu Hazawa, Firli R P Dewi, Rikinari Hanayama, Toshio Ando, Richard W Wong
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Journal Title
Journal of extracellular vesicles
Volume: 11
Issue: 11
Pages: 12275-12275
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Osteosarcoma-Derived Small Extracellular Vesicles Enhance Tumor Metastasis and Suppress Osteoclastogenesis by miR-146a-5p2021
Author(s)
Yoshihiro Araki, Hisaki Aiba, Takeshi Yoshida, Norio Yamamoto, Katsuhiro Hayashi, Akihiko Takeuchi, Shinji Miwa, Kentaro Igarashi, Tuan D. Nguyen, Kiyo-aki Ishii, Takayuki Nojima, Satoru Takahashi, Hideki Murakami, Hiroyuki Tsuchiya and Rikinari Hanayama
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Journal Title
Frontiers in Oncology
Volume: 11
Pages: 667109-667109
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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