Targeting basal autophagy as therapeutic drugs in neurodegenerative diseases
Project/Area Number |
21K07422
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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Allocation Type | Multi-year Fund |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 52020:Neurology-related
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Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
Principal Investigator |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田口 勝敏 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60462701)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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Keywords | オートファジー / 神経変性疾患 / Beclin1 / Rubicon / UVRAG / ハイスループットスクリーニング / Beclin1複合体 / 治療薬 / Basal Autophagy / 治療薬スクリーニング / Beclin-1 / NanoBiT |
Outline of Research at the Start |
神経変性疾患の多くは脳内に有害な異常タンパク質が蓄積することで発症する。オートファジー亢進薬Rapamycinはそのようなタンパク質の除去に効果的であるが、免疫抑制作用や細胞死などの副作用がある。本研究ではマイルドにオートファジー活性を亢進し、継続的に使用可能な薬剤のスクリーニングを行う。そのために、オートファジー主要因子Beclin-1とその調節因子をターゲットにしたBasal Autophagy活性化薬剤のスクリーニング系の開発を行う。具体的にはBeclin-1とその調節因子との相互作用を高感度検出システムを用いて定量化し、化合物ライブラリーを用いて新しい神経変性疾患治療薬の開発を目指す。
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Outline of Annual Research Achievements |
Becin1複合体形成を指標としたBasal Autophagy活性の測定システムの開発のために、スプリット発光タンパク質NanoBitを利用しタンパク質-タンパク質相互作用解析を行った。HEK293細胞にLgBiT-Beclin1とSmBiT-UVRAG、LgBiT-Beclin1とSmBiT-Rubicon、LgBiT-Beclin1とSmBiT(ネガティブコントロール)の組み合わせで一過的に遺伝子導入を行った。一晩培養した後、発光基質Nano-Glo Live Cell Substrateを加え、マルチモードプレートリーダーGloMaxで発行測定を行った。その結果、すべての組み合わせで発光が認められ、ネガティブコントロールとして使用したLgBiT-Beclin1とSmBiTの組み合わせでも高い発光量であった。従って、本システムではベースの値が高いため目的タンパク質の相互作用を測定するのが非常に困難であった。この問題を解決するために、一過的発現ではなく安定発現株を作製し相互作用解析を行う。現在、本ベクターに薬剤耐性マーカーを導入している。また、コントロールとして使用するATG7_KOおよびRubicon_KO細胞をCRISPR/Cas9で作製した。これらの細胞も利用しオートファジー活性を測定する予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
構築したシステムのネガティブコントロールでも活性が高かったため改良が必要となった。
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Strategy for Future Research Activity |
構築したベクターで安定発現株を作製するために、薬剤耐性遺伝子を導入する。そして、これらの細胞で相互作用の測定を行う。また、ATG7_KOやRubicon_KO細胞を作製したので、これらの細胞でも同様に安定発現株を作製し、オートファジー活性と相互作用活性の相関を確認する。
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Report
(2 results)
Research Products
(4 results)