重症筋無力症患者における胸腺腫内抗原特異的B細胞の探索

• Project/Area Number: 21K07434
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52020:Neurology-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高田 和城 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (20573223)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木下 允 大阪大学, 大学院医学系研究科, 特任講師(常勤) (10573222)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 重症筋無力症 / B細胞 / 胸腺腫

Outline of Research at the Start

重症筋無力症(Myasthenia Gravis: MG)は自己反応性の抗体により、四肢の易疲労感・筋脱力をきたす自己免疫疾患である。患者血清中の自己抗体の検出は確立しているが、抗体を産生する細胞についてはほとんど明らかとなっていない。
本研究はMG患者の中でも最も頻度が高い抗アセチルコリン受容体(AchR)抗体陽性MG患者における病原性を持った抗原特異的B細胞が最も豊富に存在すると考えられる胸腺腫サンプルを用いB細胞群のsingle cell RNA sequenceを行うことによりMG患者における病原性をもった抗原特異的B細胞の機能・分化・成熟課程を明らかにすることが目的である。

Outline of Annual Research Achievements

重症筋無力症は病原性のある神経筋接合部に対する自己抗体により四肢の易疲労感や筋脱力を来す自己免疫疾患である。疾患診断のための血中の抗体検出は古くからおこなわれているが、血中に存在する自己反応性B細胞が非常に稀であるためこれまで分離・検出は非常に困難であり、自己免疫性抗体産生細胞についてはほとんど明らかとなっておらず、その分化・成熟課程については不明である。
これまでの報告より病原性自己抗体産生B細胞は胸腺腫合併抗アセチルコリン受容体抗体陽性重症筋無力症患者では胸腺腫中で分化・成熟することが示唆されている。
本研究の目的は病原性を有する自己抗体産生B細胞の分離を行い、その機能・分化成熟機転の解析を行うことである。そのためにまず、重症筋無力症患者由来B細胞に特異的に発現している分子の有無を調べるために、2年前より行っているスタートアップ研究より本研究に着手している、抗アセチルコリン受容体抗体陽性患者の胸腺腫合併症例において、胸腺腫摘出標本からのFACSを用いたsingle cell sortingおよびRNAシークエンスを行い、その発現プロファイルの解析を行い、ターゲットとして主に重症筋無力症患者由来B細胞で特異的に発現している表面マーカーの探索を行う。
これまでに手術サンプルの処理、抗体染色、FACS、single cell sorting、RNAライブラリー作成といった一連の実験手法の確立を行うことができ、パイロットスタディーで、採取したB細胞の解析ではgerminal centerを構成する細胞の増加を認め、naive B cellからmemory B cell, plasmablastまでのB細胞を認め、B細胞自体の分化・成熟は比較的行われていると考えられた。現在、胸腺細胞および末梢血のRNAシークエンスを計画している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

手術サンプル数の減少のため得られるサンプル数が予定より少ない。
細胞のみならず、組織からのRNAの新たな解析方法の出現のため解析法の再検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

組織切片からRNAシークエンスが可能となるVisiumが今回のサンプルで可能かどうかの検討を行っている。基本的にはRNAシークエンスデータにおいて重症筋無力症B細胞に特異的に発現している表面マーカーがあればそれをターゲットとしsingle cell sortingを行う。次いでその分離細胞が実際にアセチルコリン受容体反応性の抗体を産生しているかについて確認するために、それぞれの細胞のB細胞受容体の長鎖および短鎖の可変領域のクローニングを行い、トランスフェクションすることにより実際に抗体を産生させ、それらの抗体とアセチルコリン受容体抗体との反応性をcell based　assayで確認を行う。上記方法で抗アセチルコリン受容体抗体産生B細胞を得ることができなかった場合。
アセチルコリン受容体は5つのサブユニットから構成されていることが知られているが、その内αサブユニットとの反応性が高いことが知られている。そのため抗アセチルコリン受容体のαサブユニットの蛍光標識蛋白を作成し、それをターゲットとしたsingle cell sortingを行い上記同様の手順で分離したB細胞のB細胞受容体の抗体を産生。実際にアセチルコリン受容体を反応するかについて検討を行う。
上記により抗体産生B細胞が得られれば可変領域のシークエンスも可能となり、同時に採取した末梢血単核球のB細胞受容体の可変領域の解析と合わせ、抗体の分化・成熟の解析などを進めていく。