Identification of chemicals that enhance expression of myoblast growth factor Dp71ab

Research Project

Project/Area Number	21K07875
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
Research Institution	Kobe Gakuin University
Principal Investigator	松尾雅文神戸学院大学, 総合リハビリテーション学部, 特命教授 (10157266)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000) Fiscal Year 2023: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywords	ジストロフィンDp71 / 筋芽細胞増殖因子 / エクソンスキッピング / ミニ遺伝子 / デュシェンヌ型筋ジストロフィー
Outline of Research at the Start	デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、筋芽細胞の枯渇による筋細胞の減少を特徴とする。DMDの治療法として、筋芽細胞の増殖法の確立が喫緊の課題である。申請者は、Dp71のアイソフォームの１種のDp71abが、筋芽細胞の増殖因子である結果を世界で初めて得た。本研究は、遠隔にある２エクソンのスキッピングを同時に誘導してDp71abを産生させる化合物を、作製する２蛍光発光スプライシング解析ミニ遺伝子を用いてハイスループット探索・同定し、その化合物を用いて筋芽細胞を増殖させる。本研究の成果は、画期的筋芽細胞増殖治療法を確立するものである。
Outline of Annual Research Achievements	デュシェンヌ型筋ジストロフィー（D M D）は、進行性の筋萎縮症で筋芽細胞の枯渇による筋細胞の減少を特徴とする。筋芽細胞の増殖法の確立はD M Dの有力な治療法である。申請者は、ジストロフィンDp71の２エクソン欠失型アイソフォームであるDp71abが筋芽細胞の増殖因子であることを世界で初めて明らかにした。本研究は、Dp71abの産生を促すためエクソン７１と７８の２エクソンのスキッピングを同時に誘導する化合物を同定する。そのため、遠隔２エクソンのスプライシングを解析する２蛍光ミニ遺伝子を作製し、蛍光発光法を応用したハイスループット法によりその化合物を探索する。さらに、同定した化合物をヒト筋芽細胞に投与し、Dp71ab産生増加による細胞の増殖を明らかにする。その成果は、化合物を用いた筋芽細胞の増殖治療法の確立を大きく促進する。初年度において、遠隔２エクソンのスプライシングを解析する２蛍光ミニ遺伝子の作製を図った。すでにエクソンスキッピング検出を迅速容易にはかるmCherry赤色とeGFP緑色の2色蛍光発光ミニ遺伝子のFMv2を保有している。そこで、このFMv2をさらに改良し、遠隔２エクソンのスプライシングを同時にしかも定量的に解析する多エクソン２蛍光ミニ遺伝子の構築を目指した。まず、エクソン７１と７８の配列をそれぞれ別個にFMv2に挿入したミニ遺伝子を構築した。ところが、予想に反してエクソン７１と７８はともにスプライシングを受けなかった。これは、２つのエクソンがサイズの小さなミニエクソンであることに起因していると考え、FMv2に挿入する配列のサイズを変更したミニ遺伝子を各種作製し、最適のスプライシング解析系の構築を目指している。一方、DP71abが筋芽細胞特異的増殖因子であることを明らかにした成果をまとめ、論文として発表した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 遠隔２エクソンのスプライシングを解析する２蛍光ミニ遺伝子の作製を図った。すでにエクソンスキッピング検出を迅速容易にはかるmCherry赤色とeGFP緑色の2色蛍光発光ミニ遺伝子のFMv2を保有している。そこで、このFMv2にエクソン７１と７８の配列をそれぞれ別個にFMv2に挿入したミニ遺伝子を構築した。ところが、予想に反してエクソン７１と７８はともにスプライシングを受けなかった。これは、２つのエクソンがサイズの小さなミニエクソンであることに起因していると考えられた。現在、FMv2に挿入する配列のサイズを変更したミニ遺伝子を各種作製し、最適のスプライシング解析系の構築を目指している。
Strategy for Future Research Activity	我々はDMD 遺伝子のスプライシング解析をミニ遺伝子を用いいて行ってきた。これまでに多くのエクソンで問題なく、スプライシング解析が可能なミニ遺伝子の構築に成功してきた。ところが、今回予想に反してエクソンの７１と７８のスプライシング解析系の構築に時間を要している。これは、２つのエクソンがサイズの小さなミニエクソンであることに起因していると考えられた。現在構築中のミニ遺伝子でスプライシング解析が可能になれば、あとは順調に進むものと考えている。