非コードRNAスプライスバリアントを標的とした新規鎮痛戦略の探索

• Project/Area Number: 21K08936
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55050:Anesthesiology-related
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 丸山 基世 日本医科大学, 医学部, 助教 (60709757)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂井 敦 日本医科大学, 医学部, 講師 (30386156) ; 齋藤 文仁 日本医科大学, 医学部, 准教授 (20360175)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 非コードRNA / スプライスバリアント / 一次感覚神経 / 神経障害性疼痛 / 長鎖非コードRNA / 選択的スプライシング

Outline of Research at the Start

一次感覚神経の障害は神経障害性疼痛を発症させるが、未だ十分な治療法がなく、全く新しい概念の導入による治療戦略の開発が期待される。我々は、神経機能に重要な役割を担う既知のコード遺伝子から選択的スプライシングにより産生される長鎖非コードRNAが、ホスト遺伝子とは真逆の痛覚抑制作用を、ホスト遺伝子とは異なる独自の機能を介して発揮している可能性を見出している。そこで本研究では、本lncRNAの疼痛における機能を明らかにし、本遺伝子の選択的スプライシングを標的とした新規鎮痛戦略の探索を行う。

Outline of Annual Research Achievements

一次感覚神経はがんや一部抗がん薬、虚血性障害、外傷など非常に様々な要因によって障害されることで、慢性の難治性疼痛である神経障害性疼痛の発症へとつながる。このような疼痛は非常な苦痛を伴うのみでなく、原疾患の治療に対する妨げにもなるが、未だ十分な治療法はない。そのため、全く新しい概念の導入による新規治療標的の同定が期待される。
近年、タンパク質をコードしない非コードRNAが機能性RNAとしてあらゆる生命機能に深く関わり、様々な疾患で重要な役割を担うことが明らかにされてきている。中でも、200塩基以上の長さを持つ長鎖非コードRNA（lncRNA）はタンパク質をコードするmRNAよりも多くの種類が存在するにもかかわらず、未だその大半の機能が未知である。我々は神経機能に重要な特定の遺伝子の選択的スプライシングによりホスト遺伝子のタンパク質をコードしていないスプライスバリアント（lncRNA-SV）が一次感覚神経において末梢神経傷害により劇的に発現変化することを見出している。本研究ではlncRNA-SVの神経障害性疼痛における機能を明らかにし、本遺伝子の選択的スプライシングを標的とした新規鎮痛戦略の探索を行うことを目的とした。
lncRNA-SVの一次感覚神経特異的な発現抑制は痛覚過敏を誘発した。一方でlncRNA-SVの過剰発現により神経障害性疼痛モデル動物に対する鎮痛作用が得られたが、この際、lncRNA-SVのホスト遺伝子の発現増加を伴うことが明らかとなった。lncRNA-SVによる遺伝子発現調節機構を明らかにするために、lncRNA-SVの発現操作を行った動物の一次感覚神経を用いて RNAシーケンスによる網羅的解析を行い、バイオインフォマティクスによりlncRNA-SVが関わるシグナル経路や細胞機能を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度はlncRNA-SVにより調節される一次感覚神経における遺伝子発現変化をRNAシーケンスにより網羅的に解析し、バイオインフォマティクスによりlncRNA-SVが関わるシグナル経路や細胞機能を詳細に検討した。
lncRNAは塩基対形成を介して特定のDNAやRNAと特異的に結合することにより、様々な遺伝子発現調節に機能を有している。lncRNA-SVはホスト遺伝子の選択的スプライシングにより産生されるため、lncRNA-SV生成メカニズムを明らかにするために、ホスト遺伝子のpre-mRNAに結合してlncRNA-SVの生成に寄与するスプライシング調節タンパク質の同定を予定しており、今年度はRNAプルダウン法の条件検討を行った。したがって、おおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

我々はlncRNA-SVがホスト遺伝子とは真逆の痛覚抑制作用を有することを見出しており、lncRNA-SVによる疼痛調節機構を探索することで神経障害性疼痛の鎮痛戦略の開発を目指す。
一次感覚神経由来タンパク質をビオチン標識したpre-mRNAでプルダウンし、質量分析を用いたショットガン解析により結合タンパク質を網羅的に同定する。同定したスプライシング調節タンパク質とpre-mRNAとの結合をRNA免疫沈降法により確認する。lncRNA-SVに結合するスプライシング調節タンパク質の同定により、疼痛を抑制するlncRNA-SVの発現を増加させるアンチセンス核酸となるsplice-switching oligonucleotide（SSO）の同定を試みる。