細胞表面タンパク質の網羅的解析を基盤とした卵巣がん新規診断・治療標的の同定
| Project/Area Number |
21K15386
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 49020:Human pathology-related
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
小林 信 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (60761947)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 卵巣癌 / バイオマーカー / 細胞表面タンパク質 / プロテオミクス / 卵巣がん |
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| Outline of Research at the Start |
卵巣がん特異的に発現する表面タンパク質をプロテオミクスにより網羅的に同定する。その中から正常組織における発現が殆どなく、かつ詳細未解明のタンパク質に着目し、細胞外ドメインや翻訳後修飾を特異的に認識する抗体を開発する。続いて、卵巣がん患者の手術検体を用いて候補分子の診断・予後マーカーとしての有用性を検証する。最後に培養卵巣がん細胞株と卵巣がんオルガノイドにおける貪食能を評価し、抗体薬物複合体を用いた新規治療標的としての可能性を検討する。以上のように、表面タンパク質の網羅的同定を出発点として、その組織診断や治療標的としての有用性を明らかにすることにより、卵巣がんの革新的な診断・治療戦略を推進する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
卵巣癌は最も致死率の高い婦人科がんであり、本邦においてその罹患率と粗死亡率は漸増傾向にある。しかしながら自覚症状に乏しく早期診断法が確立されていないため、約75%が進行癌として診断される。標準治療として外科手術と化学療法が併用されるが、半数以上の症例が再発し、再発例の5年生存率は約20%に留まる (Lheureux et al., CA Cancer J Clin, 2019)。分子標的治療が実用化されて20年以上経過してなお、卵巣癌においては肺癌や乳癌におけるEGFRやHER2のような腫瘍マーカーと治療戦略が一対一対応する理想的な分子標的が同定されていない。そこで本研究では、卵巣癌の約半数を占める漿液性がんに焦点を絞り、以下の要領で組織診断や治療標的として有用な標的分子の探索を施行した。第一に癌特異的に発現する細胞表面タンパク質をプロテオミクスにより網羅的に同定した。第二にその中から「正常組織における発現が殆どなく、かつ詳細未解明のタンパク質」に着目し、標的特異的に反応するモノクローナル抗体を開発した。第三に卵巣癌患者の手術検体を用いて候補分子の診断・予後マーカーとしての有用性を検証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
卵巣漿液性癌細胞株3種(OVCAR3、SKOV3、AMOC2)を対象として、全細胞画分と細胞表面画分それぞれからタンパク質を抽出した。タンパク質をトリプシン消化後に質量分析解析を施行したところ、全細胞画分としてOVCAR3は8,029個、SKOV3は8,051個、AMOC2は7,546個、細胞表面画分としてOVCAR3は5,762個、SKOV3は5,494個、AMOC2は4,977個のタンパク質を同定した。その中から卵巣癌組織に高発現し正常組織にほとんど発現しないものを、The Cancer Genome AtlasデータベースとThe Genotype-Tissue Expressionデータベースを用いて絞りこんだ。さらに細胞表面濃縮比を算出し、細胞表面に高発現するタンパク質40個を選択した。その中には既知の卵巣漿液性癌特異抗原が含まれると共に、Ingenuity経路解析でも卵巣癌シグニチャーとして検出され、抽出した分子群の妥当性が確認された。絞り込んだ40個の分子群の診断マーカーとして有用性を明らかにするため、新規性が高くかつ機能未解明のタンパク質を複数選択した。その中で特に卵巣癌において遺伝子発現の高い候補分子について、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を免疫染色可能なモノクローナル抗体の作製を行った。
作製したモノクローナル抗体を用いて卵巣癌患者の腹水中に含まれる腫瘍細胞を免疫染色したところ、本タンパク質は腫瘍細胞の細胞膜に発現を認めた。そこで同様に卵巣癌外科組織の免疫染色を施行した。結果、標的タンパク質の発現亢進は漿液性癌、ステージ、原発腫瘍の大きさ、腹膜播種の有無、手術の完遂度、再発と有意な関連を示した。さらに単変量・多変量解析を行ったところ、本タンパク質は卵巣癌の独立した再発予測因子であることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
卵巣癌の独立した再発予測因子であることが明らかとなった新規バイオマーカー候補タンパク質については、以下の要領で研究を遂行する。本分子は既存報告より細胞表面における発現が示唆されている。よってまず、癌細胞の表面における発現を免疫蛍光染色、又はフローサイトメーターを用いて評価する。次に以下の実験を施行する。1) 貪食作用による抗体の細胞内への取り込みを評価する目的で、エンドソームに移行すると蛍光を発するpHrodo色素と樹立抗体を結合する。2) 卵巣癌培養細胞株の培地中に添加し、蛍光顕微鏡とフローサイトメーターを用いて蛍光強度を評価する。3) 樹立抗体と細胞傷害性薬物であるMonomethyl auristatin Fを結合し抗体薬物複合体を作製する。4) これを同様に卵巣癌培養細胞株の培地中に様々な濃度で添加し、細胞生存率を評価する。以上より、本分子の卵巣癌を標的とした新規抗体医薬品としての有用性を評価することを目指す。さらに本分子は卵巣癌において独立した再発予測因子であることが明らかとなったことから、卵巣癌細胞株を対象としたゲノム編集実験を行い、卵巣癌増悪促進機構の解明を目指す。
また我々が絞り込んだ他の候補分子についても同様に、ホルマリン固定パラフィン包埋標本を免疫染色可能なモノクローナル抗体の作製を行う。その後卵巣癌外科組織を免疫染色し、候補分子と臨床病理学的因子や予後との相関を検討する予定である。
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Report
(1 results)
Research Products
(18 results)
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[Journal Article] YAP1 mediates gastric adenocarcinoma peritoneal metastases that are attenuated by YAP1 inhibition2021
Author(s)
Ajani JA, Xu Y, Huo L, Wang R, Li Y, Wang Y, Pizzi MP, Scott A, Harada K, Ma L, Yao X, Jin J, Zhao W, Dong X, Badgwell BD, Shanbhag N, Tatlonghari G, Estrella JS, Roy-Chowdhuri S, Kobayashi M, Vykoukal JV, Hanash SM, Calin GA, Peng G, Lee JS, Johnson RL, Wang Z, Wang L, Song S
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Journal Title
Gut
Volume: 70
Pages: 55-66
DOI
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Fahrmann JF, Irajizad E, Kobayashi M, Vykoukal JV, Dennison JB, Murage E, Wu R, Long JP, Do K-A, Celestino J, Lu KH, Lu Z, Bast RC, Hanash SM
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Journal Title
DOI
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[Journal Article] Protein citrullination as a source of cancer neoantigens2021
Author(s)
Katayama H, Kobayashi M, Irajizad E, Patel N, Mao X, Rusling L, Vykoukal J, Cai Y, Hsiao F, Yu CY, Long J, Liu J, Esteva F, Fahrmann J, Hanash S
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Journal Title
Journal for ImmunoTherapy of Cancer
Volume: 9
DOI
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Organizer
日本プロテオーム学会2021年大会
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10th Asia Oceania Human Proteome Organization Conference
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