アメロジェニンによるエピジェネティック制御機構の解明と難治性疾患への挑戦

• Project/Area Number: 21K16972
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 57030:Conservative dentistry-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 四本 かれん 九州大学, 歯学研究院, 助教 (00898322)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2022: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: アメロジェニン / ヒストン修飾 / 免疫抑制 / 皮膚移植 / マクロファージ / エピジェネティック制御

Outline of Research at the Start

先行研究でアメロジェニンが核内移行しヒストン修飾を誘導することで、マクロファージによる抗原提示を抑制することを初めて見出した。しかし、アメロジェニンが核内に移行した後、どのようなエピジェネティック制御を介して免疫抑制と創傷治癒を促進するのかは不明である。
本研究はアメロジェニンが免疫応答や創傷治癒等に与える影響、および分子メカニズムを解明するため、アメロジェニンの核内移行後のヒストン修飾における作用点の解明、また人為的にアメロジェニンの活性増強が可否を検証する。さらにこれらの結果より、アメロジェニンの投与による新しい歯周組織再生療法の開発と共に、難治性疾患の新規治療確立に向け研究の展開を図る。

Outline of Annual Research Achievements

先行研究で、アメロジェニンが核内移行しヒストン修飾を誘導することで、マクロファージによる抗原提示を抑制するという現象を初めて見出し報告した。しかし、アメロジェニンが核内に移行した後、どのようなエピジェネティック制御を介して免疫抑制と創傷治癒を促進するのかは依然不明である。本研究はアメロジェニンが免疫応答や創傷治癒等に与える影響、およびそこに至るまでの分子メカニズムを解明するため、アメロジェニンの核内移行後のヒストン修飾における作用点の解明、また人為的にアメロジェニンの活性増強が可能か否かを検証する。さらにこれらの結果をもって、アメロジェニンの投与による新しい歯周組織再生療法を開発すると共に、難治性疾患の新規治療確立に向け研究の展開を図る。
アメロジェニンが免疫抑制剤となり得るか否かを検討するため、Balb/cマウスからC57BL/6マウスへの皮膚移植における拒絶反応の解析を行なった。皮膚の採取（ドナーマウス）において腹腔麻酔し、バリカン・除毛クリームで胸部の腹背側を剃毛し、ハサミでマウスの胸部腹背側の皮膚全層を1x1cm2正方形状に切除。シャーレに生理食塩水を浸したガーゼ上に置き保存した。皮膚の移植（レシピエントマウス）においては、腹腔麻酔し、バリカン・除毛クリームで胸部の腹背側を剃毛。ハサミでマウスの胸部腹背側の皮膚全層を1x1cm2正方形状に切除。ドナー皮膚移植片にアメロジェニン(20マイクログラム分)またはPBSを塗布し、レシピエントの需要部に置き、皮膚移植片を縫合しない。その結果、アメロジェニンの初期塗布だけで対照群と比較して拒絶が延長する傾向が観察された。また、移植片壊死面積スコアに関しても有意に壊死面積の減少が確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Balb/cマウスからC57BL/6マウスへの皮膚移植における拒絶反応の解析を行なったところ、移植片におけるアメロジェニンの初期塗布だけで対照群（PBS）と比較して拒絶が延長する傾向があるという画期的な現象を確認したが、COVID-19の影響で実験計画に支障が出たためやや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

移植片におけるアメロジェニンの初期塗布だけで対照群（PBS）と比較して拒絶が延長する原因を探索するために、以下の実験を行なう予定である。① HE染色：皮膚移植10日後の移植片の組織学的変化、細胞浸潤やアポトーシスの有無を確認する。② 混合リンパ球反応（MLR）：T細胞の活性化を確認するために、移植後アメロジェニンを投与した群のドナーマウスから脾細胞を採取し、ドナーマウスの脾細胞と共培養する。CD4およびCD8陽性T細胞の変化を検討する。③ フローサイトメトリーによる解析：移植されたマウスの末梢血を採取し、フローサイトメーターを用いて、T細胞表面抗原を解析する。Th1/Th2バランスなどの炎症反応を制御する調節性T細胞（T-reg）をその特異的な転写因子（Foxp3）をマーカーとして判別し、その比率を評価する。また、同種骨髄移植に関しても同様の投与法で検討する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Extracellular vesicles derived from GMSCs stimulated with TNF-α and IFN-α promote M2 macrophage polarization via enhanced CD73 and CD5L expression. (2022)
  • Author(s): Watanabe Y, Fukuda T, Hayashi C, Nakao Y, Toyoda M, Kawakami K, Shinjo T, Iwashita M, Yamato H, Yotsumoto K, Taketomi T, Uchiumi T, Sanui T, Nishimura F.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 13344-13344
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17692-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] miR-1260b inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β mediated regulation of ER stress. (2022)
  • Author(s): Hayashi C, Fukuda T, Kawakami K, Toyoda M, Nakao Y, Watanabe Y, Shinjo T, Sano T, Iwashita M, Yotsumoto K, Shida M, Taketomi T, Sanui T, Uchiumi T, Kanematsu T, Nishimura F.
  • Journal Title: Front Cell Dev Biol Volume: 10 Pages: 1061216-1061216
  • DOI: 10.3389/fcell.2022.1061216
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Combined application of geranylgeranylacetone and amelogenin promotes angiogenesis and wound healing in human periodontal ligament cells. (2021)
  • Author(s): Yamato H, Sanui T, Yotsumoto K, Nakao Y, Watanabe Y, Hayashi C, Aihara R, Iwashita M, Tanaka U, Taketomi T, Fukuda T, Nishimura F
  • Journal Title: J Cell Biochem Volume: 122(7) Issue: 7 Pages: 716-730
  • DOI: 10.1002/jcb.29903
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Exosomes from TNF-α-treated human gingiva-derived MSCs enhance M2 macrophage polarization and inhibit periodontal bone loss (2021)
  • Author(s): Nakao Yuki、Fukuda Takao、Zhang Qunzhou、Sanui Terukazu、Shinjo Takanori、Kou Xiaoxing、Chen Chider、Liu Dawei、Watanabe Yukari、Hayashi Chikako、Yamato Hiroaki、Yotsumoto Karen、Tanaka Urara、Taketomi Takaharu、Uchiumi Takeshi、Le Anh D.、Shi Songtao、Nishimura Fusanori
  • Journal Title: Acta Biomaterialia Volume: 122 Pages: 306-324
  • DOI: 10.1016/j.actbio.2020.12.046
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] バイオ3Dプリンターを用いた、間葉系幹細胞からの骨様立法構造物作製への挑戦 (2022)
  • Author(s): 豊田真顕、梶岡俊一、福田隆男、渡辺ゆかり、林千華子、川上賢太郎、中尾雄紀、四本かれん、大和寛明、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第65回日本歯周病学会春季学術大会
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソーム内包miR-1260bによる小胞体ストレス応答制御を介した歯周炎骨吸収抑制効果 (2022)
  • Author(s): 林千華子、福田隆男、渡邊ゆかり、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、四本かれん、大和寛明、新城尊徳、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第65回日本歯周病学会春季学術大会
• [Presentation] TNF-a/IFN-a共刺激した歯肉幹細胞由来エクソソームはCD73とCD5Lを介して抗炎症性M2マクロファージを誘導する (2022)
  • Author(s): 渡邊ゆかり、林千華子、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、大和寛明、四本かれん、新城尊徳、岩下未咲、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 第156回日本歯科保存学会2022年度春季学術大会
• [Presentation] Fabrication of stem cell-based scaffold-free bone-like 3D structures. (2022)
  • Author(s): Toyoda M, Kajioka S, Fujimoto R, Hayashi C, Kawakami K, Watanabe Y, Nakao Y, Yotsumoto K, Sanui T, Fukuda T, Nakayama K, Nishimura. F.
  • Organizer: The 108th Annual Meeting of the American Academy of Periodontology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] miR-1260b inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β. (2022)
  • Author(s): Hayashi C, Kawakami K, Toyoda M, Watanabe Y, Nakao Y, Yotsumoto K, Yamato H, Shinjo T, Sanui T, Fukuda T, Nishimura F.
  • Organizer: The 108th Annual Meeting of the American Academy of Periodontology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] バイオ３Dプリンターを用いた、間葉系幹細胞からの骨様立法構造物作製への挑戦 (2022)
  • Author(s): 豊田真顕、梶岡俊一、川上賢太郎、林千華子、渡邊ゆかり、中尾雄紀、四本かれん、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 令和4年度日本歯周病学会九州五大学 日本臨床歯周病学会九州支部合同研究会
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソーム内包miR-1260bによる小胞体ストレス応答制御を介した抗炎症作用. (2021)
  • Author(s): 林千華子、福田隆男、渡邊ゆかり、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、四本かれん、大和寛明、新城尊徳、讃井彰一、西村英紀.
  • Organizer: 第64回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] ゲラニルゲラニルアセトンとアメロジェニンの歯周組織再生への複合的効果 (2021)
  • Author(s): 大和寛明、讃井彰一、四本かれん、中尾雄紀、渡邊ゆかり、林千華子、相原良亮、岩下未咲、田中麗、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 2021年度日本歯科保存学会春季学術大会(第154回)
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソーム内包miR-1260bによる小胞体ストレス応答制御を介した歯槽骨吸収抑制作用 (2021)
  • Author(s): 林千華子, 福田隆男, 渡邊ゆかり, 川上賢太郎, 豊田真顕, 中尾雄紀, 四本かれん，大和寛明，新城尊徳，讃井彰一，西村英紀
  • Organizer: 2021年度日本歯科保存学会秋季学術大会(第155回)
• [Presentation] Exosomes from TNF-α-treated human gingiva-derived MSCs enhance M2 macrophage polarization and inhibit periodontal bone loss. (2021)
  • Author(s): Yuki Nakao, Yukari Watanabe, Chikako Hayashi, Hiroaki Yamato, Karen Yotsumoto, Terukazu Sanui, Takanori Shinjo, Takao Fukuda, Fusanori Nishimura.
  • Organizer: Kyudai Oral Bioscience & OBT Research Center 5th Joint International Symposium（国際学会）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Chikako Hayashi, Takao Fukuda, Yukari Watanabe, Kentaro Kawakami, Masaaki Toyoda, Yuki Nakao, Karen Yotsumoto, Hiroaki Yamato, Takanori Shinjo, Terukazu Sanui, Fusanori Nishimura (2021)
  • Author(s): Chikako Hayashi, Takao Fukuda, Yukari Watanabe, Kentaro Kawakami, Masaaki Toyoda, Yuki Nakao, Karen Yotsumoto, Hiroaki Yamato, Takanori Shinjo, Terukazu Sanui, Fusanori Nishimura
  • Organizer: Kyudai Oral Bioscience & OBT Research Center 5th Joint International Symposium（国際学会）
  • Int'l Joint Research