Elucidation of regenerative muscle fiber maturation mechanism of M2-like macrophages and Tcf4-positive fibroblasts

Research Project

Project/Area Number	21K17028
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
Research Institution	Tokyo Dental College
Principal Investigator	小川雄大東京歯科大学, 歯学部, 助教 (10875694)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2021)
Budget Amount *help	¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000) Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	骨格筋再生 / Tcf4陽性線維芽細胞 / M2様マクロファージ / 基底膜
Outline of Research at the Start	高齢者における筋機能の低下は、筋機能維持機構の衰えが一因となる。そのため筋再生能力の維持が、高齢者の筋機能低下を防ぐ重要な鍵となる。なかでも組織恒常性マクロファージ（M2様マクロファージ）と線維芽細胞の核内転写因子T-cell factor 4（Tcf4）は再生筋線維の成熟に重要であることが報告されてきたが、その詳細は十分に解明されていない。申請者はM2様マクロファージとTcf4陽性線維芽細胞が幼若な再生筋線維に進入する現象を明らかにした。これらの成果を基盤として、再生筋線維、M2様マクロファージおよびTcf4陽性線維芽細胞の異種細胞間コミュニケーションによる再生筋線維成熟機構を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	本研究は骨格筋再生過程において、M2様マクロファージとTcf4陽性線維芽細胞が再生筋線維内に進入することにより、再生筋線維に与える影響を明らかにすることである。今日までにM2様マクロファージとTcf4陽性線維芽細胞が骨格筋再生における再生筋線維成熟を促進させることが報告されているが、組織学的構造からも基底膜である筋鞘を乗り越えてこれら筋線維外の細胞が再生筋線維にアプローチする現象の詳細は明らかとなっていない。我々は、M2様マクロファージとTcf4陽性線維芽細胞がそれぞれ骨格筋再生過程において再生筋線維内に進入すること発見し、この現象が再生筋線維の成熟に肯定的な作用をもたらすと考えた。このことが明らかとなれば、サルコペニアやフレイルなどによる骨格筋障害の治療法の新たな方針決定に繋がると考える。この現象の解明にはまず、再生筋線維、M2様マクロファージ、そしてTcf4陽性線維芽細胞の三者の細胞間のコミュニケーションを形態学的裏付けに基づいて解析を行うことが重要である。まず骨格筋再生過程におけるM2様マクロファージとTcf4 陽性線維芽細胞の局在とこれらの細胞間コミュニケーションの解析を行う必要がある。そのため透過型電子顕微鏡を用いた免疫組織化学的染色により組織学的局在の検索と超微細構造を確認する。さらに、クロドロン酸リポソームの投与により、マクロファージ除去モデルを作製し、マクロファージ非存在下における筋損傷に対するTcf4陽性線維芽細胞への影響を確認する。ここまでの報告は第127回日本解剖学会総会・全国学術集会にて発表した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究はマクロファージ除去モデルの作製が第一の要となるが、クロドロン酸リポソームを用いたモデル作製は当初上手くいかず難航した。試薬を調整することで、モデル作製は成功したが、そのため当初の計画からはやや遅れをとってしまった。しかしながら、マクロファージ除去モデルが完成してからは、マクロファージ非存在下における筋損傷に対するTcf4陽性線維芽細胞への影響を検討した局在の検索や透過型電子顕微鏡を用いた免疫組織学的染色による超微細構造の確認が遂行できた。
Strategy for Future Research Activity	現在までに進行してきた課題に追加し、M2様マクロファージとTcf4陽性線維芽細胞の遊走・進入を経時的に観察する必要がある。そのため、M2様マクロファージは骨髄由来の単球のケモカインレセプターであるCX3CR1を、Tcf4陽性線維芽細胞は線維芽細胞の核内転写因子Tcf4の上流におけるシグナルタンパクであるβcateninをそれぞれtd-Tomatoによってラベリングする。これにより、筋損傷による骨格筋再生過程におけるM2様マクロファージとTcf4陽性線維芽細胞を経時的に追跡することが可能になる。