Development of Semisynthetic Probe for Imaging ER stress
| Project/Area Number |
21K19048
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
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| Research Institution | Kyushu University (2022-2023)
Osaka University (2021) |
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Principal Investigator |
堀 雄一郎 九州大学, 理学研究院, 教授 (00444563)
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| Project Period (FY) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | ミスフォールディング / スイッチ機能 / UGGT / 小胞体ストレス / フォールディングセンサー / ミスフォールディング蛋白質 / 蛍光イメージング / Semisyntheticプローブ / ERストレス |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、蛍光スイッチ機能を持つ合成蛍光色素とミスフォールディング蛋白質の分子認識機能を持つ蛋白質を連結した“Semisynthetic”プローブを開発する。色素と蛋白質を細胞内で連結するために、独自のPYPタグ蛋白質ラベル化技術を応用する。このプローブを用いて、小胞体ストレス下のミスフォールディング蛋白質を生細胞で検出する。更に、この技術を応用して糖尿病発症過程の解明に役立てることを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT)は、ミスフォールディングしたタンパク質を結合するタンパク質であり、その結合部位に蛍光色素も結合する。このことから、ミスフォールディングタンパク質の結合に伴い色素の蛍光強度が変化するスイッチ機能を持つ分子プローブを設計すれば、ミスフォールディングタンパク質を検出できると考えた。そこで、本研究では、UGGTにPYPタグを融合し、スイッチ機能を持つ蛍光色素で標識したSemisyntheticプローブを開発した。これまでの研究で、UGGTのN末端にPYPタグを融合させたPYP-UGGTの遺伝子をクローニングした。一方、この遺伝子を大腸菌で発現させようとしたものの、その発現量が少なく、発現量向上が課題であった。本年度の研究では、UGGTのN末端ではなく、C末端にPYPタグを融合した遺伝子を作成し、遺伝子発現を試みた。これらの遺伝子には、HisタグおよびGSTタグをN末端に融合させておき、これらのタグを利用してタンパク質を精製することとした。大腸菌にて遺伝子発現を行ったところ、His-GST-UGGT-PYPの発現が確認された。Hisタグを利用した方法では、目的タンパク質の単離はできなかったものの、GSTタグを利用したアフィニティ精製とゲルろ過精製を行ったところ、His-GST-UGGT-PYPを得ることができた。このHis-GST-UGGT-PYPとPYPプローブの一つであるPCAF-TAMRAを反応させたところ、タンパク質を示すバンドの位置から蛍光が観測された。また、スイッチ機能を持つ色素を導入したPYPタグプローブを反応させたところ、PCAF-TAMRAと同様にラベル化反応が進行し、タンパク質と化合物からなるSemisynthetic probeの構築ができることが示された。
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Report
(3 results)
Research Products
(13 results)
