Synthesis of neoglycoproteins using oligosaccharide-transfer Activity with immobilized endoglycosidases

• Project/Area Number: 21K19090
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: Takegawa Kaoru 九州大学, 農学研究院, 教授 (50197282)
• Project Period (FY): 2021-07-09 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2021: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: エンドグリコシダーゼ / ネオグリコプロテイン / 固定化酵素 / ENGase / 糖転移活性 / 糖転移 / 糖タンパク質 / 糖鎖変換技術

Outline of Research at the Start

本研究ではまず、固定化脱糖鎖用ENGaseと固定化糖鎖転移用ENGaseの最適反応条件の検討を行う。さらに糖タンパク質の糖鎖の根本部分に存在するフコース残基を遊離するため、ENGaseとフコシダーゼを固定化したカラムによるGlcNAc-タンパク質の効率的生産の検討を行う。これらの条件検討により脱糖鎖＆糖鎖付加が可能な固定化カラムが完成すれば、均一糖鎖への変換を実施して、種々のN-結合型糖鎖を付加した場合のバイオ医薬品（具体的には抗体IgGを用いる）の活性評価を実施する予定である。

Outline of Final Research Achievements

We investigated efficient deglycosylation techniques by immobilizing α-L-fucosidase and endoglycosidase (ENGase), which are necessary for deglycosylation of sugar chains from glycoproteins. Both enzymes were found to retain their activity after immobilization on NHS-Activated Agarose. LC/MS measurements confirmed deglycosylation of IgG using both immobilized enzymes. We searched for a novel ENGase capable of deglycosylation of multi-branched glycans of human-derived glycoproteins. We expect that Barnesiella intestinihominis possesses ENGases to facilitate the utilization of complex-type N-glycans from host cells.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

現在市販されているバイオ医薬品の多くが糖タンパク質であるが、最も高い生物活性を示す糖鎖構造については未だ明らかにされていない。そこで、本研究では煩雑な工程であったエンドグリコシダーゼの糖鎖転移反応による糖タンパク質均一糖鎖変換技術を固定化酵素を用いて行うことを目指した。条件検討の結果、固定化酵素による糖タンパク質の脱糖鎖は効率良く行うことが可能になった。

Research Products

• [Journal Article] Mechanistic insights into Schizosaccharomyces pombe GT-A family protein Pvg3 in the biosynthesis of pyruvylated β1,3-galactose of N-linked oligosaccharides (2023)
  • Author(s): Fukunaga Takamasa、Watanabe Masahiro、Nakamichi Yusuke、Morita Tomotake、Higuchi Yujiro、Maekawa Hiromi、Takegawa Kaoru
  • Journal Title: Journal of Bioscience and Bioengineering Volume: - Issue: 6 Pages: 00074-9
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2023.03.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of novel endo-β-N-acetylglucosaminidase from Bacteroides nordii that hydrolyzes multi-branched complex type N-glycans. (2022)
  • Author(s): Bienes KM, Tautau FAP, Mitani A, Kinoshita T, Nakakita S, Higuchi Y, Takegawa K
  • Journal Title: Journal of Biosciemce and Bioengineering Volume: 133
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Barnesiella属腸内細菌が保有する3種類のENGaseについての解析 (2023)
  • Author(s): 土井佳奈子、樋口裕次郎、竹川薫
  • Organizer: 令和５年度日本生化学会九州支部例会
• [Presentation] Analysis of the Utilization Mechanism of Complex Type N-glycan by Intestinal Bacteria Barnesiella (2023)
  • Author(s): Doi K, Higuchi Y, Takegawa K
  • Organizer: GLyco 26 (Taiwan)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Barnesiella属腸内細菌のENGaseを用いたN-型複合型糖鎖の資化機構解析 (2023)
  • Author(s): 土井佳奈子、樋口裕次郎、竹川薫
  • Organizer: 第42回日本糖質学会年会
• [Presentation] 複合型糖鎖を資化するBarnesiella属腸内細菌の解析 (2023)
  • Author(s): 土井佳奈子、中山二郎、樋口裕次郎、竹川薫
  • Organizer: 日本生物工学会支部大会福岡
• [Presentation] Barnesiella属腸内細菌ゲノムに存在するエンドグリコシダーゼの諸性質に 関する研究 (2022)
  • Author(s): 土井佳奈子、篠田あかり、中山二郎、竹川 薫
  • Organizer: 第59回化学関連支部合同九州大会
• [Presentation] Characterization of novel ENGases from B. intestinihominis that hydrolyze complex type N-glyca (2022)
  • Author(s): Kanako Doi, Yujiro Higuchi, Kaoru Takegawa
  • Organizer: JSBBA West 5th Student Forum
• [Presentation] 3種の固定化酵素による均一糖鎖含有糖タンパク質合成システムの構築 (2021)
  • Author(s): 本田明梨 、木下崇司 、竹川薫
  • Organizer: 第 27 回 日本生物工学会九州支部 大分大会