生体膜の疎水性領域を可視化する新規凍結割断レプリカ標識法の開発

• Project/Area Number: 22K19252
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 藤田 秋一 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (60282232)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 正谷 達謄 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (70614072)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2023: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2022: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 脂肪酸 / フリーズフラクチャー / 脂質 / 電子顕微鏡 / ナノスケール解析 / 微細局在 / ナノスケール / 多価不飽和脂肪酸

Outline of Research at the Start

本研究では急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法を改良することにより、新規凍結割断レプリカ標識法を開発し、今まで困難であった膜脂質の疎水性領域である各種脂肪酸の微細分布の解析を可能にすることを目的とする。近年、不飽和脂肪酸（UFA）の生体内での増加が発癌、癌転移、精神疾患、インスリン抵抗性の改善など種々の生理及び病理機能に関与することがわかってきた。UFAが、どのように細胞に作用して機能関与するのかなど作用機序は全く不明である。新規凍結割断レプリカ標識法を開発することにより、世界に先駆けて、UFAがもたらす生理的作用の機序解明の基礎的情報を獲得できると確信する。

Outline of Annual Research Achievements

膜脂質に関しては有力な解析技術が少ないため、まだまだ未知の点が多く残されている。代表者らは、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法（Quick-freezing & freeze-fracture replica labeling method: QF-FRL）によって膜脂質を特異的に標識することが可能であることを示し、各種脂質の二次元的分布をナノレベルで解明することに成功した。生体膜を構成する脂質は“頭部”の親水性部位とそれに結合する脂肪酸の “尾部”である疎水性部位により構成される。QF-FRL法では、生体膜を構成する脂質の“親水性頭部”に結合するプローブで標識することにより、生体膜を構成する各種脂質の微細分布を可視化することは可能となった。しかしながら、今まで用いてきたQF-FRL法では疎水性“尾部”の脂肪酸は全く解析することが不可能である。本研究では、QF-FRL法をさらに改良することにより、新規凍結レプリカ脂肪酸標識法を新たに開発し、生体膜における疎水性領域をナノレベルで解析することを目的とした。新規凍結レプリカ脂肪酸標識法を用いて電子顕微鏡により脂肪酸の微細分布を検討する実験を行なった。エッチングを行なったレプリカ薄膜では、アルキン化パルミトオレイン酸あるいはアルキン化アラキドン酸共に、生体膜において特異的な標識を得ることはできなかった。一方、エッチングをしなかったレプリカ薄膜では、アルキン化アラキドン酸のアルキン基を標識することに成功した。これらの結果から、生体膜に存在するアラキドン酸が親水性領域側にアルキン基、つまり脂肪酸の末端が露出していることが示唆された。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Harvard University(米国)
• [Journal Article] Coordinated regulation of phosphatidylinositol 4-phosphate and phosphatidylserine levels by Osh4p and Osh5p is an essential regulatory mechanism in autophagy (2024)
  • Author(s): Muramoto Moe、Mineoka Nanaru、Fukuda Kayoko、Kuriyama Sayuri、Masatani Tatsunori、Fujita Akikazu
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes Volume: 1866 Issue: 4 Pages: 184308-184308
  • DOI: 10.1016/j.bbamem.2024.184308
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Unique asymmetric distribution of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in Toxoplasma gondii revealed by nanoscale analysis (2023)
  • Author(s): Konishi Rikako、Fukuda Kayoko、Kuriyama Sayuri、Masatani Tatsunori、Xuan Xuenan、Fujita Akikazu
  • Journal Title: Histochemistry and Cell Biology Volume: 160 Issue: 4 Pages: 279-291
  • DOI: 10.1007/s00418-023-02218-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Essential roles of phosphatidylinositol 4-phosphate phosphatases Sac1p and Sjl3p in yeast autophagosome formation (2022)
  • Author(s): Muramoto Moe、Yamakuchi Yuki、Konishi Rikako、Koudatsu Shiomi、Tomikura Hiromu、Fukuda Kayoko、Kuriyama Sayuri、Kurokawa Yuna、Masatani Tatsunori、Tamaki Hisanori、Fujita Akikazu
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids Volume: 1867 Issue: 9 Pages: 159184-159184
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2022.159184
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 酵母細胞でのオートファジーにおけるオートファジックボディーの選択的崩壊機構とオートファジックボディー膜におけるホスファチジルセリンの選択的増加、 (2022)
  • Author(s): 山口優希、黒川夕奈、向達汐美、福田佳代子、正谷達謄、藤田秋一
  • Organizer: 第96回 日本生化学大会
• [Presentation] ヒトmalaria原虫Plasmodium falciparumでのラフト主成分の糖脂質GM3の局在 (2022)
  • Author(s): 向達 汐美, 正谷 達謄, 小西 里可子, 黒川 夕奈, 山口 優希, 富奥 甘奈, 福田 佳代子, ハキミ ハッサン, 麻田 正仁, 金子 修, 藤田 秋一
  • Organizer: 第96回 日本生化学大会
• [Remarks] 鹿児島大学 共同獣医学部 分子細胞生物学 藤田秋一研究室
  • URL: https://www.facebook.com/profile.php?id=100057246648140