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原核生物で発見された真核生物型ユビキチンシステムの機能解析

Publicly Offered Research

Project AreaNew aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation
Project/Area Number 15H01179
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Biological Sciences
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

金井 保  京都大学, 工学研究科, 講師 (10346083)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2016)
Budget Amount *help
¥9,490,000 (Direct Cost: ¥7,300,000、Indirect Cost: ¥2,190,000)
Fiscal Year 2016: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2015: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Keywordsユビキチン / アーキア / 原核生物 / 好熱菌 / 進化 / 再構成
Outline of Annual Research Achievements

本年は、難培養性好熱性アーキアのUblシステムが多数のタンパク質が共存する細胞内においても機能しうるかを検証した。ホストとして培養可能でありかつ形質転換法が確立している超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisを用いて本Ublシステム構成因子の発現を試みた。まずは、Ublオペロン全体をT. kodakarensis内での発現プラスミドに組込んだ(pRPEx01p)。また本菌のUblはGly-Glyモチーフの後方にペプチド配列が存在する前駆体型(pUbl)であることから、この部分を遺伝子工学的に改変して成熟体Ublを発現するベクター(pRPEx01m)も作製した。これらのベクターをT. kodakarensisに導入し、ASW-YT+Pyr培地で70°C, 24 h培養した。得られた細胞抽出液用いてWestern blot解析を行った結果、共にUb, E1, E2の発現は確認されたものの、E3の発現は確認されなかった。そこでE3の開始コドンを確認したところTTGであり、翻訳開始効率の低下が予想されたことから、これをATGに改変したベクターpRPEx02p/pRPEx02mをそれぞれ作製した結果、E3を含む全タンパク質の発現を確認した。次に、T. kodakarensis KPD1株のゲノム内に、in vitro再構成系において本系の基質タンパク質の遺伝子を導入した株(KPD1Mc株)を作製した。本株にpRPEx02p/pRPEx02mを導入して同様に実験を行った結果、Western blot解析によりUbl化されたタンパク質の存在が確認された。この結果より、本系は細胞内においてもタンパク質修飾活性を示すことが判明し、本系が真核生物のUb系と同様に実際の細胞内でもタンパク質修飾機能を有することが強く示唆された。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2016 Annual Research Report
  • 2015 Annual Research Report
  • Research Products

    (5 results)

All 2017 2016 2015

All Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Presentation] 熱性アーキアで発見されたユビキチンシステムの細胞内におけるタンパク質修飾機能解析2017

    • Author(s)
      萬代由莉恵、橘髙瑞奈、布浦拓郎、金井 保、跡見晴幸
    • Organizer
      日本農芸化学会2017年度大会
    • Place of Presentation
      京都女子大学
    • Year and Date
      2017-03-17
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
  • [Presentation] In vitro reconstitution of the ubiquitin system found in an unculturable thermophilic archaeon, ’Candidatus Caldiarchaeum subterraneum’2016

    • Author(s)
      Tamotsu Kanai, Rikako Fujimoto, Mizuna Kittaka, Masahiro Tokuhara, Yoshizum Ishino, Yoshihiro Takaki, Hideto Takami, Ken Takai, Yasuo Mori, Takuro Nunoura and Haruyuki Atomi
    • Organizer
      11th International Congress on Extremophiles (Extremophiles2016)
    • Place of Presentation
      京都大学百周年記念館
    • Year and Date
      2016-09-12
    • Related Report
      2016 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 未培養好熱性アーキアで発見されたユビキチンシステムのin vitro再構成系の構築2015

    • Author(s)
      2.橘高瑞奈、金井保、藤本理夏子、徳原将弘、安枝裕貴、清中茂樹、石野良純、高木善弘、高見英人、浜地格、高井研、森泰生、布浦拓郎、跡見晴幸
    • Organizer
      第16回極限環境生物学会
    • Place of Presentation
      東京海洋大学 品川キャンパス
    • Year and Date
      2015-11-08
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] 好熱性アーキア‘Ca. Caldiarchaeum subterraneum’のユビキチン様遺伝子群の生化学的機能解析2015

    • Author(s)
      1.金井保、橘高瑞奈、藤本理夏子、徳原将弘、石野良純、高木善弘、高見英人、高井研、森泰生、布浦拓郎、跡見晴幸
    • Organizer
      第67回日本生物工学会大会
    • Place of Presentation
      城山観光ホテル(鹿児島)
    • Year and Date
      2015-10-26
    • Related Report
      2015 Annual Research Report
  • [Presentation] 未培養好熱性アーキアCaldiarchaeum subterraneum で発見されたユビキチン様タンパク質の機能解明2015

    • Author(s)
      1.橘髙瑞奈、金井 保、藤本理夏子、徳原将弘、安枝裕貴、清中茂樹、石野良純、高木善弘、高見英人、浜地格、高井 研、森 泰生、布浦拓郎、跡見晴幸
    • Organizer
      日本農芸化学会関西支部 第491回講演会
    • Place of Presentation
      富山県立大学
    • Year and Date
      2015-09-19
    • Related Report
      2015 Annual Research Report

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Published: 2015-04-16   Modified: 2019-12-27  

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