個体動物における組織深部分子活性化イメージングのための新規蛍光タンパク質の開発

• Project Area: Resonance Biology for Innovative Bioimaging
• Project/Area Number: 18H04748
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: National Institute for Physiological Sciences
• Principal Investigator: 村越 秀治 生理学研究所, 脳機能計測・支援センター, 准教授 (90608142)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥10,400,000 (Direct Cost: ¥8,000,000、Indirect Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2019: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2018: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: 蛍光タンパク質 / フェルスター共鳴エネルギー移動 / 蛍光寿命イメージング / 2光子蛍光顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

組織浸透性の高い長波長に最適化された新規“無蛍光”赤色蛍光タンパク質を開発し、2光子蛍光寿命イメージングによる組織内神経細胞内分子活性化イメージングに応用することが本研究の目的である。現在までに、赤色蛍光タンパク質を鋳型にし、ランダム変異導入により、吸収はあるが量子収率がほぼ0の色素タンパク質（ShadowR）の開発に成功した。また、変異導入にあたって、側鎖が外側に向いている疎水性アミノ酸をより親水性のものに置換することによって、細胞内タンパク質への非特異的結合を大きく減少させることができた。さらに、2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて、mRuby2とShadowRのペアを各種FRETプローブ（CaMKII, Ras, LOV2）に応用することで発現効率やシグナルの大きさ・安定性が優れていることを確認した。これらの結果をまとめて論文（Murakoshi et al. Scientific Reports 2019）を出版した。

Research Progress Status

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] 二光子蛍光寿命イメージングと色素タンパク質によるタンパク質間相互作用の可視化 (2020)
  • Author(s): 村越秀治、植田大海
  • Journal Title: 光学 Volume: 49 Pages: 2025-2025
• [Journal Article] Reciprocal Activation within a Kinase-Effector Complex Underlying Persistence of Structural LTP. (2019)
  • Author(s): Saneyoshi T, Matsuno H, Suzuki A, Murakoshi H, Hedrick NG, Agnello E, O'Connell R, Stratton MM, Yasuda R, and Hayashi Y
  • Journal Title: Neuron Volume: 102 Issue: 6 Pages: 11991210-11991210
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2019.04.012
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] ShadowR: a novel chromoprotein with reduced non-specific binding and improved expression in living cells (2019)
  • Author(s): Murakoshi Hideji、Horiuchi Hiroshi、Kosugi Takahiro、Onda Maki、Sato Aiko、Koga Nobuyasu、Nabekura Junichi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 12072-12072
  • DOI: 10.1038/s41598-019-48604-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rap2 and TNIK control Plexin-dependent tiled synaptic innervation in C. elegans. (2018)
  • Author(s): Chen Xi, Shibata AC, Hendi A, Kurashina M., Fortes E, Weilinger N, MacVicar B, Murakoshi H, Mizumoto K.
  • Journal Title: eLife Volume: 7
  • DOI: 10.7554/elife.38801
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Neuronal Synaptic Connections Organized by Small Numbers of Molecules. (2018)
  • Author(s): Murakoshi H.
  • Journal Title: Minorities and Small Numbers from Molecules to Organisms in Biology. Springer Singapore. Volume: - Pages: 7-13
  • DOI: 10.1007/978-981-13-2083-5_2
  • ISBN: 9789811320828, 9789811320835
• [Journal Article] 共焦点レーザー走査顕微鏡vi．FLIM-②タイムドメイン (2018)
  • Author(s): 村越秀治
  • Journal Title: 実験医学増刊 羊土社 Volume: - Pages: 57-58
• [Presentation] Spatiotemporal manipulation and imaging of signaling molecules in neurons (2020)
  • Author(s): Hideji Murakoshi
  • Organizer: The 50th NIPS International Symposium
  • Invited
• [Presentation] Optogenetic manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines of neurons (2020)
  • Author(s): Hideji Murakoshi
  • Organizer: UK-Japan Neuroscience Symposium
  • Invited
• [Presentation] Optical manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines of neurons (2019)
  • Author(s): 村越秀治
  • Organizer: 第60回日本組織細胞化学会総会・学術集会
  • Invited
• [Presentation] シナプス内シグナル分子の光操作と分子活性イメージング (2019)
  • Author(s): 村越秀治
  • Organizer: "Chemistry for Neuroscience 2019”研究会
  • Invited
• [Presentation] Optical manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines of neurons. (2019)
  • Author(s): Hideji Murakoshi
  • Organizer: Current Trends and Future Directions of Synapse-Circuit Plasticity Research
  • Invited
• [Presentation] Optogenetic induction of synaptic plasticity at single synapses by photoactivatable CaMKII (2019)
  • Author(s): Hideji Murakoshi
  • Organizer: Cold Spring Harbor Laboratory Meeting
  • Invited
• [Presentation] Optogenetic manipulation of CaMKII activity in synapses. (2019)
  • Author(s): Hideji Murakoshi
  • Organizer: The 16th International Membrane Research Forum.
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Imaging Protein Activity by 2-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (2019)
  • Author(s): 村越秀治
  • Organizer: The 66th NIBB Conference, ABiS International Symposium
  • Invited
• [Presentation] Optical manipulation and imaging of signaling molecules in dendritic spines of neurons (2018)
  • Author(s): 村越秀治
  • Organizer: 第70回日本細胞生物学会第51回日本発生生物学会合同学会
  • Invited
• [Remarks] 生理学研究所 村越研究室
  • URL: http://www.nips.ac.jp/multiphoton/
• [Remarks] 村越研究室
  • URL: http://www.nips.ac.jp/multiphoton/