2019 Fiscal Year Annual Research Report
temperature sensing of cell cyctoplasm and cell nucleus
| Project Area | Integrative understanding of biological phenomena with temperature as a key theme |
|---|
| Project/Area Number |
15H05929
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
今本 尚子 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (20202145)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-06-29 – 2020-03-31
|
| Keywords | 核―細胞質間輸送 / 熱ストレス / Hikeshi / Importin / 温度制御実験 / 熱ショックタンパク質Hsp70 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Hikeshiは、39.9℃という生理的温度で分子シャペロンHsp70を核に運ぶ。最終年度は、温度上昇でHikeshi輸送が駆動するメカニズムの解析に集中した。Hikeshi（野生型と疾患点変異タンパク質）とHsc70（HSPA8）それぞれを大腸菌で発現させたリコンビナントタンパク質を完全精製して解析に用いた（両タンパク質はin vitro輸送再構築で活性を持つ）。thermal shift assayを用いて、それぞれのタンパク質の熱安定性と構造変化を調べたところ、Hsc70のTm値はATP添加時61.0 ℃、ADP添加時58.2 ℃、HikeshiはTm値58.1 ℃であることがわかり、一般的な熱ストレス温度（39-45 ℃）ではHsp70とHikeshiはともにタンパク質構造が安定であることがわかった。一方で、疾患点変異HikeshiのTm値が低く、熱安定性が失われていることがわかった。
精製Hsp70とHikehsiタンパク質を用いてpull down assayを行った結果、他タンパク質を加えなくても、25 ℃から45 ℃にかけた温度上昇に伴って強く結合していくことがわかった。これはこれまでの解析では予想していなかった結果であった。両タンパク質が結合する温度を詳細に解析すると、細胞内でHsp70が核に移行する温度と一致した。結合の条件検討を行った結果、結合にはATPと疾患変異部位であるHikeshiの疎水ポケットに相互作用すると考えられる界面活性の両方が必要であることがわかり、Hsp70との結合にHikeshi疾患変異部位である疎水ポケットが関与する可能性が示唆された。
また、Importin alphaの中で熱安定性の高いサブファミリーと低いサブファミリーを発現する安定発現細胞株を樹立し、温度以前的に核に集積していくタンパク質を解析できる実験系を構築した。
|
| Research Progress Status |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
|
