2021 Fiscal Year Annual Research Report
Strctural and Functional Dynamics on Proteins Related to Biometal Dynamics
| Project Area | Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System |
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| Project/Area Number |
19H05761
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (70183051)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 生体鉄 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造機能解析 / ヘム鉄 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの腸管上皮細胞での鉄動態（還元、吸収、輸送、貯蔵など）に関連する一連のタンパク質の構造と機能を基盤に、細胞内での鉄動態を分子から細胞のレベルで明らかにする事を目的としている。腸管上皮細胞のモデル細胞を構築するために、ヒト結腸ガン由来のCaco-2細胞に鉄還元酵素Dcytbを発現させた。食餌内に含まれると考えられる様々な有機酸、糖などの化合物を酸化鉄と共存させて、細胞内の鉄吸収を観察した結果、リンゴ酸とフルクトースが鉄吸収を促進させることがわかった。鉄、フルクトース存在下でのDcytb結晶作成を試みたが、鉄・フルクトース結合型の構造は得られなかった。
Dcytbにより還元された鉄（Fe2+）を腸管上皮細胞内に吸収する（膜輸送する）トランスポーターDMT1を、ハムスターCHO細胞の細胞膜に発現させることに成功し、ベシクル化によりそのDMT1含有の細胞膜を回収することが可能となった。
病原菌は自身の増殖に必要な鉄を得るために、宿主赤血球よりヘム（鉄ポルフィリン錯体）を奪取し取り込む。しかし、細胞内ヘムは過剰になると毒性を示すために、それを回避するためのヘム排出ポンプ（ヘムエクスポーター）を有する。その構造機能解析の研究結果を論文にまとめ投稿した（現在、rivise後の再査読中）。
鉄を活性中心に含むダイズ根粒菌の酸素センサータンパク質システムFixLJの動的構造と機能の関連を明らかにする目的で、FixJのin vitroおよびin cell NMR構造解析を行っている。今年度は詳細な構造情報を得るために常磁性ランタニドを導入したFixJを調製し、そのスペクトル測定に成功し、おおよその構造を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Caco-2細胞を用いたヒト腸管上皮細胞をモデル細胞の構築は順調に進んでいる。Dcytbの発現とその細胞内での機能評価も可能となり、Dcytb変異体の発現もできている。Dcytbに関しては、分子レベルの研究と細胞レベルの研究を結びつけることが可能となりつつある。
DMT1は、大腸菌、酵母、昆虫細胞をホストとした発現系構築を試みてきたが、CHO細胞での発現に成功し、単離精製から構造機能解析による分子レベルでの研究推進の目処がたった。
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| Strategy for Future Research Activity |
腸管上皮モデル細胞を用いてDcytbの構造機能研究を大きく展開する。変異体を用いて、鉄結合、分子内電子伝達、還元剤（アスコルビン酸）との相互作用などを検討する。また、構造柔軟性のためにX線結晶構造解析では構造を観測できなかったC末端の６０残基の役割を明らかにする。他のタンパク質との相互作用部位と期待している。さらに、このモデル細胞へのDMT1の発現も試み、細胞を用いたDMT1機能解析の準備をする。DMT1の分子構造を得るために、CHO細胞から作成したベシクルからの単離精製のプロトコールを確立する。
FixJのin vivo NMR構造解析の目処はたったので、in cell NMRのための準備を開始する。
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[Journal Article] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II2021
Author(s)
H. Kwon, J. Basran, C. Pathak, M. Hussain, S. L. Freeman, A. J. Fielding, A. J. Bailey, N. Stefanou, H. A. Sparkes, T. Tosha, K. Yamashita, K. Hirata, H. Murakami, G. Ueno, H. Ago, K. Tono, M. Yamamoto, H. Sawai, Y. Shiro, H. Sugimoto, E. L. Raven, and P. C. E. Moody
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Journal Title
Angewandte Chemie International Edition
Volume: 60
Pages: 14578～14585
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Short-lived intermediate in N <sub>2</sub> O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography2021
Author(s)
T. Nomura, T. Kimura, Y. Kanematsu, D. Yamada, K. Yamashita, K. Hirata, G. Ueno, H. Murakami, T. Hisano, R. Yamagiwa, H. Takeda, C. Gopalasingam, R. Kousaka, S. Yanagisawa, O. Shoji, T. Kumasaka, M. Yamamoto, Y. Takano, H. Sugimoto, T. Tosha, M. Kubo and Y. Shiro
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 118
Pages: e2101481118
DOI
Peer Reviewed
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