2022 Fiscal Year Annual Research Report
Strctural and Functional Dynamics on Proteins Related to Biometal Dynamics
| Project Area | Integrated Biometal Science: Research to Explore Dynamics of Metals in Cellular System |
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| Project/Area Number |
19H05761
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
城 宜嗣 兵庫県立大学, 理学研究科, 特任教授 (70183051)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤井 仁美 長崎大学, 工学研究科, 准教授 (50584851)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 生体鉄 / 鉄動態 / トランスポーター / センサータンパク質 / 構造機能解析 / ヘム鉄 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの腸管上皮細胞での鉄動態に関連する一連のタンパク質（鉄還元酵素Dcytb、還元鉄トランスポーターDMT1、鉄シャペロンPCBP、鉄貯蔵タンパク質フェリチンFt）を研究対象とした。Dcytbにより還元された鉄（Fe2+）を腸管上皮細胞内に吸収するDMT1を、ハムスターCHO細胞の細胞膜に発現させ、ベシクル化によりそのDMT1含有の細胞膜を回収後、単離精製することに成功した。低温電子顕微鏡法により構造解析するために、多量に精製する方法を検討した。PLA法によって、HeLa細胞に発現させたDcytbとDMT1が細胞膜上で近接して存在していることを見出した。腸管上皮細胞のモデル細胞であるヒト結腸ガン由来Caco-2細胞でも同様の分析を試みている。この結果を基に、細胞毒性の高い還元鉄（Fe2+）を細胞内外に拡散させないために両タンパク質複合体を形成しているとの作業仮説を立てて、Dcytb/DMT1複合体の単離精製を検討し始めた。同様の観点から、DMT1とPCBP、PCBPとFtの相互作用を検討した。PCBPとFtの相互作用は、SEC、Mass Photometry、X線小角散乱などの手法で検討できている。
病原菌は自身の増殖に必要な鉄を得るために、宿主赤血球よりヘム（鉄ポルフィリン錯体）を奪取し取り込む。しかし、細胞内ヘムは過剰になると毒性を示すことから、ヘム濃度を感知するシステムを有しており、過剰のヘムを細胞外に排出するヘム排出ポンプ（ヘムエクスポーター）を有する。ヘムトランスポーターの構造機能解析の研究を、今年度、論文として発表した。また、ヘム濃度センサータンパク質を阻害する化合物は有効な抗菌薬となる可能性があることから、候補化合物の検索を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今までDcytbの構造解析には成功していたが、Dcytbへの鉄結合に関する実験的な証拠は得られていなかった、Native MASS法により、Dcytbー鉄複合体形成の予備的証拠が得られた。 DMT1は、大腸菌、酵母、昆虫細胞をホストとした発現系構築を試みてきたが、CHO細胞での発現に成功し、単離精製から構造機能解析による分子レベルでの研究推進の目処がたった。さらに、DcytbとDMT1の細胞内での複合体形成の予備的な実験証拠が得られたので、分子レベルでの研究に進展可能である。同様に、ヒトの腸管上皮細胞での鉄動態に関連する一連のタンパク質がお互いに相互作用していることを示す証拠も得られ始めて、細胞・分子レベルでの鉄動態理解への突破口が見え始めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
分子レベルでの研究では、DMT1、Dcytb/DMT1複合体、DMT1/PCBP複合体、PCBP/Ft複合体の構造解析（低温電子顕微鏡による）を進めていく。細胞レベルの研究では、PLA分析と免疫沈降法により、Caco-2細胞とHeLa細胞内でのこれらのタンパク質複合体の形成の確証を得る。
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