2020 Fiscal Year Annual Research Report
Functions and mechanisms of reguratory nascent chains
| Project Area | Multifaceted Proteins: Expanding and Transformative Protein World |
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| Project/Area Number |
20H05926
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
千葉 志信 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (20523517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内藤 哲 北海道大学, 農学研究院, 農学研究院研究員 (20164105)
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| Project Period (FY) |
2020-11-19 – 2025-03-31
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| Keywords | 翻訳アレスト / 機能性新生鎖 / リボソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、新生鎖の状態で、制御された翻訳アレストという機構を用い、細胞内環境をモニタリングし、遺伝子発現制御を介して細胞の機能を調節する「機能性新生鎖」の生理機能と分子機構の解明を目指している。代表者・千葉は、放線菌由来のアレスト因子ApcA、ApdA、および、根粒菌由来のApdPについて、大腸菌および枯草菌を宿主とし、変異解析および生化学的な解析を行った。その結果、これらの因子に共通の配列が翻訳アレストに重要であることが示唆された。一方、下流遺伝子の発現制御に関し、大腸菌、枯草菌を宿主として用いた解析からは、アレスト依存的な制御の証拠がみいだせなかった。恐らく、本来の宿主に特異的な転写もしくは翻訳制御機構がこれらのアレスト因子による下流遺伝子の制御に重要な役割を担っているものと思われる。
出口トンネル狭窄部位は，新生ペプチドと相互作用することで，新生ペプチドに依存したリボソーム停滞を引き起こすことに関与すると考えられている。しかしながら，その分子実態は，まだ不明の点が多い。研究分担者の内藤は，出口トンネル狭窄部位を構成するリボソームタンパク質であるuL4とuL22に導入した変異が，真核生物における新生ペプチドに依存したリボソーム停滞に与える効果を解析することで，この問題を追求しようとしている。
2020年度は，2021年度以降の研究のための準備として，シロイヌナズナの培養細胞への形質転換法について，GFP蛍光を指標に形質転換効率を評価し，MM2d株を用いた解析の見通しがついた。また，これまでに作出した狭窄部位に変異をもつトランスジェニックシロイヌナズナは変異型遺伝子(uL4D:FLAG)と野生型遺伝子(uL4A)の両方を発現する。そこで，uL4D:FLAG遺伝子のみを発現する植物の作出に向けた交配を行い，F1植物が得られた段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2020年度は４ヶ月程度の研究期間であったが，次年度以降の研究に必要な検討と準備を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者の千葉は、ApcA、ApdA、ApdPの変異解析を引き続き継続し、これらの因子に共通で見られた翻訳必須モチーフのアミノ酸配列のどのような性質がアレストにクリティカルであるのかを明らかにする。また、枯草菌のオルソゴナルリボソームを構築し、リボソームRNAの変異解析を行うためのプラットフォームを作成する。
研究分担者の内藤の研究では，培養細胞系の構築と並行して，変異型リボソームの比率を高めることができれば，可能な解析の幅が広がる。そこで，２つの方法で，変異型リボソームの比率を高めた実験系構築の方途を探る。１つ目は遺伝学的方法である。uL4，uL22とも，２つのパラログ遺伝子があり，これまでに構築した変異型のuL4D:FLAG，uL22A:FLAGを持つ株はいずれも，野生型の遺伝子を１コピー持つ。当該野生型パラログ遺伝子のノックアウト株との掛け合わせにより，変異型リボソームのみを持つ株を作出し，得られた株から試験管内翻訳系を調製する。２つ目は，生化学的方法による。変異型uL4D:FLAG，uL22A:FLAGから，FLAGタグを用いて変異型リボソームを濃縮した試験管内翻訳系の調製に挑戦する。
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