2022 Fiscal Year Annual Research Report
Development of cross-scale technologies for investigating correlations of structures, dynamics, and functions of intracellular molecules
| Project Area | New cross-scale biology |
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| Project/Area Number |
21H05252
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
水上 進 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30420433)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 敬宏 京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (80423060)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
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| Keywords | クロススケール / マルチ計測 / 1分子超解像イメージング / 細胞内標識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題①の細胞内局所環境を可視化するプローブ技術の開発については、前年度までに開発した局在型pH蛍光プローブを用いて、マイトファジーの可視化に取り組んだ。HaloTag蛋白質をミトコンドリアのマトリクスに発現させて、pH蛍光プローブをミトコンドリア内に局在化させた後、薬剤によりマイトファジーを誘導した。レシオ蛍光イメージングにより、マイトファジーによるミトコンドリア内pHの酸性化の可視化に成功した。
課題②のマルチ計測・制御プラットフォーム技術の開発については、標的の細胞内標的蛋白質に対して蛋白質ラベル化技術と細胞内クリックケミストリーを利用して二種類の機能性分子（蛍光色素と電子顕微鏡で観察可能な構造体）を修飾するための分子モジュールを合成した。また、低分子が結合する蛋白質モジュールのプラスミド設計および蛋白質の精製を行った。低分子モジュールの構築が完了し次第、低分子-蛋白質複合体を形成し、電子顕微鏡で観察する予定である。
課題③の高速１分子超解像イメージング技術の開発については、ブリンキングプローブの誘導体化を行った。新たに開発したブリンキングプローブの酸解離定数（pKcycl）、1分子ブリンキング特性を評価し、化合物構造との相関を調べた。さらに、生細胞標識方法の最適化とアクチン細胞骨格の高速1分子超解像イメージングへの応用を進めた。福間班との共同研究では、In-cell AFMと全反射蛍光顕微鏡の複合機を立ち上げ、接着斑の形成動態研究のための技術開発を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね当初の予定通りに研究計画が進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題①の細胞内局所環境を可視化するプローブ技術の開発については、本年度開発した細胞内局在が可能なpH蛍光プローブを用いて 、pH変化を伴う様々な細胞内現象を可視化する。具体的には、オートファジーに着目し、領域内研究者と共同してpH変化を引き起こす前のオートファジーの進行過程を可視化する。
課題②のマルチ計測・制御プラットフォーム技術の開発については、引き続き標的の細胞内標的蛋白質に対して蛋白質ラベル化技術と細胞内クリックケミストリーを利用して蛍光色素と電子顕微鏡で観察可能な構造体を修飾するための分子モジュールを開発する。
課題③の高速１分子超解像イメージング技術の開発については、超高速１分子観察の結果をもとに引き続きプローブ改良を行う。また、秒オーダーの高速1分子超解像画像を取得し、細胞内の様々なスケールのメゾ複雑体の構造・動態・機能の相関を明らかにする。In-cell AFM－全反射蛍光顕微鏡複合機での技術的問題 (蛍光褪色等)を解決し、1分子イメージングとの複合化に発展させる。
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Research Products
(19 results)
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[Journal Article] A highly photostable and bright green fluorescent protein2022
Author(s)
Masahiko Hirano, Ryoko Ando, Satoshi Shimozono, Mayu Sugiyama, Noriyo Takeda, Hiroshi Kurokawa, Ryusaku Deguchi, Kazuki Endo, Kei Haga, Reiko Takai-Todaka, Shunsuke Inaura, Yuta Matsumura, Hiroshi Hama, Yasushi Okada, Takahiro Fujiwara, Takuya Morimoto, Kazuhiko Katayama, Atsushi Miyawaki
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Journal Title
Nat. Biotechnol.
Volume: 40
Pages: 1132-1142
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] A methodology for creating mutants of G‐protein coupled receptors stabilized in active state by combining statistical thermodynamics and evolutionary molecular engineering2022
Author(s)
Taisei Yamamoto, Satoshi Yasuda, Rinshi S. Kasai, Ryosuke Nakano, Simon Hikiri, Kanna Sugaya, Tomohiko Hayashi, Satoshi Ogasawara, Mitsunori Shiroishi, Takahiro K. Fujiwara, Masahiro Kinoshita, Takeshi Murata
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Journal Title
Protein Sci.
Volume: 3
Pages: e4425
DOI
Peer Reviewed
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