2021 Fiscal Year Annual Research Report
Genetic analysis of nuage formation regulated by non-domain type proteins
| Project Area | Biology of Non-domain Biopolymer |
|---|
| Project/Area Number |
21H05275
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
甲斐 歳恵 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 教授 (40579786)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2026-03-31
|
| Keywords | 非ドメイン型タンパク質 / 非膜オルガネラ / ヌアージュ / piRNA |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
フェーズIのDsupを発現するトランスジェニックショウジョウバエについて、個体または組織レベルでのX線照射実験を行ったが、試した条件下の範囲内ではX線照射に対する耐性は認められなかった。今後、培養細胞を用いてさらに詳細に検討していく。Heroタンパク質については作成済みの10－20ライン程度のノックダウン株のストレス耐性や寿命の解析を進めつつある。
フェーズIIでは、我々がこれまで同定したヌアージュの構造要素であるTudorファミリータンパク質の機能解析を発展させた。Kotsと名付けた、マウスTdrd1ホモログの１つ、(CG9925)について、特に精巣でヌアージュ近傍にPiNGbodyという非ドメイン型バイオポリマーを形成し、それが精巣でのpiRNA産生に関与することを明らかにし、2022年３月にピアレビュージャーナルに発表した(DOI:10.3389/fmolb.2022.8 18302)。 また、Tdrd5(Tej)が、他のヌアージュタンパク質、Vasa、Tdrd9 (SpnE)との相互作用により、核膜近傍でpiRNA前駆体のプロセシングに関わる結果を得ており、2022年3月の時点では論文投稿準備中である。さらに、Tej、SpnEのTudorドメインファミリータンパク質およAub、Ago3、PiwiのPIWIファミリータンパク質での分子間相互作用と新規タンパク質同定する目的で、BioID法によるヌアージュ構成タンパク質の網羅的な相互作用解析を開始しており、来年度初期には質量分析による候補因子の同定及び遺伝学的解析によるヌアージュ構築やトランスポゾン抑制における機能を解析予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和4年4月より KO ショウジョウバエ作成等を行うための専門知識と経験を持つ研究協力者が参画し、遺伝的解析が進めやすくなった。
フェーズIについて、Dsup以外のクマムシタンパク質を発現するショウジョウバエを作成する可能性を検討する。また、Hero タンパク質については、作成済みの10－20ライン程度のノックダウン株のストレス耐性や寿命の解析を進めつつある。通常の研究室内至適温度の生育状況では、表現型を示すものが少なく、条件検討を重ねる予定である。
フェーズII では、更なるヌアージュ新規因子の解明に向けて、Aub、Ago3、Piwiの３つのタンパク質をに相互作用するタンパク質の同定を目指している。既にビオチンリガーゼを融合させたトランスジーンをショウジョウバエ卵巣内で発現するためのトランスジェニックの作成を開始しており、発現を確認した。今後は個体の組織内でビオチン化を行うための条件検討（ハエえさに混ぜる量やラベルする期間）の検討を重ねる。ユビキチンリガーゼとして機能する可能性があるヌアージュ因子、Kumo(Tdrd4 ホモログ)についてはS2細胞もしくは試験管内でユビキチン化活性を検出するためのプラスミド構築を進めつつある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
多くのヌアージュの構成因子が知られているが、それぞれがどのように相互作用し、巨大な非膜オルガネラを構築しているか、その分子機序は不明な点が多い。その解明を目指し、BioIDのような近位依存性ビオチン化とそれに続く質量分析法によって、新規因子の同定と機能解析をさらに推し進める。具体的には既に着手しつつあるPIWIファミリータンパク質に加えて、我々の研究対象の中心であるTudorドメインタンパク質のSpnEやTej、またRNAヘリカーゼであるVasタンパク質についても同様の解析を進める方針である。
また、非膜オルガネラであるヌアージュに局在しつつもまだその機能が明らかとなっていないSquやBoYbの解析に着手する。2022年はノックアウト変異体や傾向タンパク質のノックイン、抗体作成などを開始する。さらに、ユビキチンリガーゼ活性を持つ可能性があるKumo（Tdrd4 ホモログ）について、ユビキチン化活性の検証と、その活性と非膜オルガネラ構造体の構築への影響を精査していく。
|
