2014 Fiscal Year Annual Research Report
| Project Area | Chemical Biology using bioactive natural products as specific ligands: identification of molecular targets and regulation of bioactivity |
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| Project/Area Number |
23102002
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
半田 宏 東京医科大学, 医学部, 教授 (80107432)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 天然物リガンド / 分散性磁性ビーズ / 固定化 / アフィニティ精製 / 標的タンパク質 / 質量分析 / 生体内作用機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らは、分散性ポリマー磁性ビーズ（半田ビーズ）を利用するアフィニティ精製によって、薬剤などの生物活性物質の標的タンパク質を単離し、質量分析によって同定する技術を構築してきた。本研究課題では、特異な生物活性を持つ天然物リガンドの標的タンパク質の単離・同定を半田ビーズの活用によって達成し、天然物リガンドが示す生物活性の生体内作用機構、及び天然物リガンド標的タンパク質が関与する生体反応のシグナルネットワークの解明を目指している。
天然物の化学構造や活性を基盤に、これまでに多種多様な生物活性物質が産み出されている。オキサゾールやチアゾールといったヘテロ環は生物活性天然物においてしばしば見られる部分構造である。加えて、フッ素が導入された化合物は薬理作用を改善させる機能を持つことが知られている。今回、アポトーシス活性を指標に、天然物を模倣したベンゼン環を置換基に持つフッ素化チアゾール群の抗がん活性を評価したところ、広範囲のがん細胞に対し、p53の状態に関係なく、数μＭで細胞増殖阻害を示すフッ素化チアゾールが存在することがわかった。当該フッ素化チアゾールの標的タンパク質をアフィニティ精製によって単離・同定するべく、構造活性相関研究を経て、フッ素化チアゾール固定化半田ビーズを作製した。がん細胞から調整した粗抽出液と半田ビーズを混合し、洗浄工程を経て、フッ素化チアゾールに結合するタンパク質群を得た。競合阻害実験により、フッ素化チアゾールに特異的に結合するタンパク質（２種）を決定し、質量分析によって同定したところ、プロヒビチン1,2であった。プロヒビチンはアポトーシスに関わる因子であることから、フッ素化チアゾールはプロヒビチンと結合し、p53とは無関係に抗がん活性を示すと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで展開してきた薬剤固定化半田ビーズの作製方法を、多様な官能基を有する天然物リガンドに適用し、様々な天然物リガンド固定化半田ビーズを作製してきた。天然物リガンド固定化半田ビーズを用いた標的タンパク質のアフィニティ精製では、不活性体を用いた対照実験や過剰量のリガンドを用いた競合阻害実験などにより、天然物リガンドに特異的に結合するタンパク質（群）を単離し、質量分析によって同定してきた。
本研究期間にて、ビタミンK2やサリチル酸、ステロイドといった天然物リガンドのみならず、ビスフェノールやベスナリノン、フッ素化チアゾールなど、特異な生物活性を示す合成化合物の特異的結合タンパク質を単離・同定してきた。リガンドを利用した結合タンパク質の生化学的解析などを通じ、天然物リガンドを含む様々な生物活性物質の標的タンパク質を決定し、生物活性物質の生体内作用機構の一端を解明してきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
天然物リガンドが示す化学構造の多様性に応じて、半田ビーズ上に天然物リガンドを効率的、かつ確実に固定化できる手法の確立を引き続き検討する。標的タンパク質のアフィニティ精製に用いるタンパク質ライブラリ（粗抽出液）は、天然物リガンドに応答する培養細胞や組織から適切な条件（界面活性剤の利用など）を用いて調整する。天然物リガンドに結合するタンパク質（群）のアフィニティ精製では、これまでと同様、天然物リガンドの不活性体を用いた対照実験や過剰量の天然物リガンドを利用した溶出実験、競合阻害実験などを通じて得られた結果を総合的に判断し、天然物リガンドに特異的に結合するタンパク質（群）を決定する。質量分析によってこれらタンパク質（群）を同定し、天然物リガンドを活用したタンパク質の生化学的解析などにより、天然物リガンドの標的タンパク質を同定し、天然物リガンドが示す生物活性の詳細を分子レベルで解明する。
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[Journal Article] SV40 VP1 major capsid protein in its self-assembled form allows VP1 pentamers to coat various types of artificial beads in vitro regardless of their sizes and shapes2015
Author(s)
M.-A. Kawano, K. Doi, H. Fukuda, Y. Kita, K. Imai, T. Inoue, T. Enomoto, M. Matsui, M. Hatakeyama, Y. Yamaguchi, H. Handa
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Journal Title
Biotechnol. Rep.
Volume: 5
Pages: 105-111
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Structure of the human cereblon-DDB1- lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs2014
Author(s)
P. Chamberlain, A. Lopez-Girona, K. Miller, G. Carmel, B. Pagarigan, B. Chie-Leon, E. Rychak, L. Corral, Y. Ren, M. Wang, M. Riley, S. Delker, T. Ito, H. Ando, T. Mori, Y. Hirano, H. Handa, T. Hakoshima, T. Daniel, B. Cathers
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Journal Title
Nat. Struct. Mol. Biol.
Volume: 21
Pages: 803-809
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] A trifluorinated thiazoline scaffold leading to pro-apoptotic agents targeting prohibitins2014
Author(s)
A. Perez-Perarnau, S. Preciado, C. M. Palmeri, C. Moncunill-Massaguer, D. Iglesias-Serret, D. M. Gonzalez-Girones, M. Miguel, S. Karasawa, S. Sakamoto, A. M. Cosialls, C. Rubio-Patino, J. Saura-Esteller, R. Ramón, L. Caja, I. Fabregat, G. Pons, H. Handa, F. Albericio, J. Gil, R. Lavilla
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Journal Title
Angew. Chem. Int. Ed.
Volume: 53
Pages: 10150-10154
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Inhibition of protein SUMOylation by davidiin, an ellagitannin from Davidia involucrata2014
Author(s)
M. Takemoto, Y. Kawamura, M. Hirohama, Y. Yamaguchi, H. Handa, H. Saitoh, Y. Nakao, M. Kawada, K. Khalid, H. Koshino, K. Kimura, A. Ito, M. Yoshida
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Journal Title
J. Antibiot. (Tokyo)
Volume: 67
Pages: 335-338
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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