2012 Fiscal Year Annual Research Report
Regulation of DNA repair machinery by K6- and K63-linked polyubiquitin chains
| Project Area | New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation |
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| Project/Area Number |
24112005
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
太田 智彦 聖マリアンナ医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60233136)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | ユビキチン / BRCA1 / DNA修復 / 乳癌 / 薬剤感受性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本計画研究の目的は、DNA相同組換え修復(HDR)経路でユビキチン修飾が果たす役割を解析する一方で、ガンにおけるこのメカニズムの異常を検出し、治療標的とバイオマーカー開発の基盤となすことである。平成24年度は下記の結果を得た。
１）各種DNA損傷に対するHDRにおけるE3活性の役割については、研究者らは平成24年度前期までの研究結果から、BRCA1のE3活性がDNA一本鎖損傷をきたすCPT11およびPARP阻害剤によるDNA損傷時の複製後修復経路においてClaspinのユビキチン化を介してChk1のリン酸化およびDNA相同組換え修復に必須であることを明らかにしたが、この知見をさらに詳細に解析するためにTALEN法を用いてBRCA1遺伝子改変HCT116細胞を作成した。
２）ヒストンおよびヘテロクロマチン形成とBRCA1との関わりに関してはBRCA1とダイマーを形成するBARD1がクロマチン上でHP1を介してメチル化ヒストンH3に結合することを明らかにした。また、NPM1もヒストンのみならず、HP1と直接結合することがわかった。
３）BRCA1-BARD1とE2(UbcH5)を用いてユビキチンK6鎖の試験管内合成系を樹立した。これをスクリーニング系に用いて抗K6抗体の樹立を試みた。K6ユビキチン鎖ペプチドにてウサギを免役してポリクローナル抗体を作成したが、K6鎖への特異性は十分ではなかった。そこでモノクローナル抗体を作成すべく、マウスを免役して脾細胞とNS-1細胞のハイブリドーマを作成した。
４）ガン治療のバイオマーカーの解析については、乳ガン検体におけるユビキチン関連HDR遺伝子の体細胞変異を解析するための半導体マイクロチップ次世代シークエンサーの条件設定が完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各種DNA損傷に対するHDRにおけるE3活性の役割を解析するための細胞の感受性と修復因子の核内 foci形成を指標としたsiRNAスクリーニングについてはRAD51のoff-target effectの問題から研究が進んでいないが、それに代わり、TALENを用いた遺伝子改変技術の応用に取り組んでいる。その他の研究については概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度は下記を行う予定である。
１）TALEN法にて作成したE3死活型BRCA1変異I26AノックインHCT116細胞を用いてヘテロクロマチン領域の相同組換え修復の解析を行う。また、エストロゲン受容体による転写によって引き起こされるDNA損傷がBRCA1のE3活性によって変化するか否かを解析する。
２）BARD1とHP1ならびにNPM1の相互作用の解析を行い、結合を阻害する変異の同定とその表現型の解析を行う。
３）ユビキチンK6鎖モノクローナル抗体を作成する。
４）乳ガン検体におけるユビキチン関連HDR遺伝子の体細胞変異を明らかにする。
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Research Products
(7 results)
