2015 Fiscal Year Annual Research Report
Ｋ６およびＫ６３ユビキチン鎖によるＤＮＡ修復制御機構
| Project Area | New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation |
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| Project/Area Number |
24112005
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
太田 智彦 聖マリアンナ医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60233136)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | ユビキチン / BRCA1 / DNA修復 / 乳癌 / 薬剤感受性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチン修飾はDNA損傷応答に必須な役割を果たしており、DNA損傷のタイプに応じて異なったE3リガーゼが機能している。研究代表者は新規作成した抗HERC2抗体を用いた質量分析計によってHERC2結合蛋白質を同定した。本年度はこのうちDNAヘリカーゼであるBLM複合体について重点的に解析を行った。HERC2の免疫沈降物のウェスタンブロットにてBRCA1、BLM, Top3a, RMI1, RMI2, RPA1およびRPA2の結合が確認された。siRNAを用いた構成サブユニットの発現抑制による結合状態の解析から、BLM/Top3a/RMI1/RMI2複合体はBLMを介して結合していることが判明した。一方、BRCA1とRPAはBLM非依存的にHERC2に結合していた。おもしろいことに非ストレス状態の可溶性核分画におけるBLM-RPA結合はHERC2に依存しており、Dox誘導性shRNAによるHERC2発現抑制あるいはMitomycin C によるDNA複製ストレスによってこの結合は顕著に阻害された。この際いずれの条件下でも、RPAの複合体形成様式が大きく変化し、分子量が似た小さな複合体になることがSuperose 6を用いたゲル濾過解析から明らかとなった。BLM複合体はDNAのG-quadruplex構造を解除するのに必須の役割を果たしているが、HERC2の抑制によってG-quadruplexは顕著に増加し、BLM機能にHERC2が重要な役割を果たしていることが示唆された。また、HERC2の抑制によってChk1の中等度の活性化が認められたが、逆にHERC2抑制細胞ではDNA複製ストレス時にChk1の本来の活性化が起こらないことが明らかとなった。これらのHERC2の作用にHERC2のE3活性がどのように関与しているのかを明らかにするため、CRISPR/Cas9を用いてホモおよびヘテロにHERC2のC末端77アミノ酸を欠失したHCT116細胞を作成した。欠失アミノ酸にはHECTドメインのユビキチン結合部位が含まれているが、HERC2のタンパク質安定性に影響がないことをウェスタンブロットにて確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
種々の条件下での質量分析によって得られたHERC2結合タンパク質には上記以外にも多数のDNA複製に重要なタンパク質が得られており、プレリミナリーではあるが、これらの機能解析も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
①HERC2とBLM複合体の機能解析をさらに詳細に進めていく。
②HERC2に結合する他のDNAヘリカーゼに関する解析を進める。
③CRISPR/Cas9にてC末端欠失細胞に加え、E3活性を死活させるHERC2点変異のノックイン細胞を作成し、DNA複製ストレス応答におけるHERC2 E3活性の役割を明らかにする。
④MS解析の結果からプロテアソームの構成因子が全てHERC2と結合することがわかっており、上記のDNA複製制御においてHERC2を介したプロテアソームの関わりがどのようなものかを探索する。
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