選択的なポリユビキチン鎖検出・定量法の開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation
• Project/Area Number: 24112008
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (80462779)
• Project Period (FY): 2012-06-28 – 2017-03-31
• Keywords: ユビキチン / プロテアソーム / タンパク質分解 / 質量分析計 / 定量プロテオミクス / アフィニティープローブ

Outline of Annual Research Achievements

ユビキチンシグナルの全貌解明を目的とし、以下の解析を行った。
1. 質量分析によるユビキチン鎖の識別定量法の確立：生体内では8種類の異なるユビキチン鎖リンケージが存在するが、Q-Q-Orbitrap型質量分析計を用いたPRM（Parallel Reaction Monitoring）法により、複雑試料から全てのユビキチンリンケージを超微量（100 amol）から定量する系を確立し、細胞内で生成するユビキチンシグナルを内在性の発現レベルで解析することが可能となった。次いで、ユビキチン修飾系のデコーダー分子ユビキチン結合タンパク質について細胞内で相互作用するユビキチン鎖を網羅的に定量解析することで、細胞内のユビキチン鎖の使い分けを明らかにした。一方、領域内で見出されたアセチル化ユビキチン、リン酸化ユビキチンについてもPRM法による絶対定量法を確立し論文として発表した。
2．ポリユビキチン鎖長決定法の開発：基質に付加したユビキチン鎖長を決定する新手法Ub-ProT（ubiquitin chain-protection from trypsinization）法を確立し、PRM法によるユビキチン鎖の絶対定量法を組み合わせることで、細胞内に存在する各ポリユビキチン鎖の平均鎖長を決定した。
3．ユビキチン化基質の網羅解析
ユビキチン鎖に対する新規アフィニティープローブTR-TUBE（trypsin resistant-tandem ubiquitin binding entity）と抗ユビキチン化ペプチド抗体を用いて、ユビキチン化基質の網羅的同定に成功し論文として発表した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ユビキチン鎖およびユビキチンの翻訳後修飾の絶対定量法、ユビキチン鎖の長さ、ユビキチン化基質の網羅的同定法を既に確立し、順次、領域内研究者の研究に応用している。平成26年度の中間評価（全体評価A）において「研究の進展は順調であり、高感度質量分析によるユビキチン鎖の新規解析を担当することで本領域の要の一つとなっている。」と評されたとおり、領域の発展に貢献している。

Strategy for Future Research Activity

計画通り、以下の研究を推進する。
１．質量分析計によるポリユビキチン鎖絶対定量法の開発・応用：ユビキチン鎖の絶対定量法は既に確立済みであり、今後も引き続き、領域内の各研究者と連携し重要基質のユビキチン鎖の構造識別と定量を実施する。また、ユビキチンの新しい翻訳後修飾を探索すると共に絶対定量系を開発する。
２．ポリユビキチン鎖長決定法の開発・応用：これまで出芽酵母抽出液中の各ユビキチン鎖の平均鎖長を決定することに成功しており、今後はヒト培養細胞における解析を推進する。また、領域内の各研究者と連携し、重要基質のユビキチン鎖長解析を実施する。
３．複雑なポリユビキチン鎖の検出法の開発・応用：ごく最近、分岐鎖が細胞内に普遍的に存在する可能性が示唆されたため、質量分析計のMiddle-down解析により、内在性の分岐鎖を検出・定量する系を早急に確立する。
４. ポリユビキチン化基質の網羅的同定法の開発・応用：これまでTR-TUBEと抗ユビキチン化ペプチド抗体を組み合わせたユビキチン化基質の網羅的同定法を開発してきたが、さらにサンプル間の比較を可能にするため、定量プロテオミクスの手法を導入する。また、TR-TUBEは変性条件下においてもユビキチン鎖結合能を保持していることが明らかとなったため、完全変性条件下におけるポリユビキチン化基質の網羅的同定法を早急に開発し、臨床サンプルに応用する。

Research Products

• [Journal Article] Mutations in deubiquitinase USP8 cause Cushing's disease (2015)
  • Author(s): Reincke, M., Sbiera, S., Hayakawa, A., Theodoropoulou, M., Osswald, A., Beuschlein, F., Meitinger, T., Mizuno-Yamasaki, E., Kawaguchi, K., Saeki, Y., Tanaka, K., Wieland, T., Graf, E., Saeger, W., Ronchi, CL., Allolio, B., Buchfelder, M., Strom, TM., Fassnacht, M., and Komada, M.
  • Journal Title: Nature Genetics Volume: 47 Pages: 31-38
  • DOI: 10.1038/ng.3166
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ubiquitin acetylation modulates polyubiquitin chain elongation (2015)
  • Author(s): Ohtake, F., Saeki, Y., Sakamoto, K., Ohtake, K., Nishikawa, H., Tsuchiya, H., Ohta, T., Tanaka, K., and Kanno, J.
  • Journal Title: EMBO Rep. Volume: 16 Pages: 192-201
  • DOI: 10.15252/embr.201439152
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The Unexpected Role of Polyubiquitin Chains in the Formation of Fibrillar Aggregates (2015)
  • Author(s): Morimoto, D., Walinda, E., Fukada, H., Sou, Y-S., Kageyama, S., Hoshino, M., Fujii, T., Tsuchiya, H., Saeki, Y., Arita, K., Ariyoshi, M., Tochio,H., Iwai, K., Namba, K., Komatsu, M., Tanaka, K. and Shirakawa, M.
  • Journal Title: Nature Commun. Volume: 6 Pages: 6116
  • DOI: 10.1038/ncomms7116
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A comprehensive method for detecting ubiquitinated substrates using TR-TUBE (2015)
  • Author(s): Yoshida, Y., Saeki, Y., Murakami, A., Kawawaki, J., Tsuchiya, H., Yoshihara, H., Shindo, M., and Tanaka, K.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 112 Pages: 4630-4635
  • DOI: 10.1073/pnas.1422313112
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin (2014)
  • Author(s): Koyano, F., Okatsu, K., Kosako, H., Tamura, Y., Go, E., Kimura, M., Kimura, Y., Tsuchiya, H, Yoshihara, H., Hirokawa, T., Endo, T., Fon, E.A., Trempe, J., Saeki, Y., Tanaka, K. and Matsuda, N.
  • Journal Title: Nature Volume: 510 Pages: 162-166
  • DOI: 10.1038/nature13392
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Pba3-Pba4 heterodimer acts as a molecular matchmaker in proteasome α-ring formation (2014)
  • Author(s): Takagi, K., Saeki, Y., Yashiroda, H., Yagi, H., Kaiho, A., Murata, S., Yamane, T., Tanaka, K., Mizushima, T. and Kato, K.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Commun. Volume: 450 Pages: 1110-1114
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.06.119
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] ユビキチンコードの全容解明を目指して (2015)
  • Author(s): 佐伯 泰
  • Organizer: 日本農芸化学会2015大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 岡山大学（岡山）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
  • Invited
• [Presentation] Elucidating the proteasome dynamics and cellular ubiquitin code (2014)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: The 5th International Symposium on Life Science in Toyama
  • Place of Presentation: 富山大学（富山）
  • Year and Date: 2014-12-11 – 2014-12-11
  • Invited
• [Presentation] A comprehensive analysis of ubiquitin linkages and length specificities of ubiquitin-binding proteins (2014)
  • Author(s): Yasushi Saeki
  • Organizer: 1st International Meeting for New Aspects of the Ubiquitin Research
  • Place of Presentation: 国際高等研究所レクチャーホール（京都）
  • Year and Date: 2014-11-10 – 2014-11-10
  • Invited
• [Remarks] 研究室ホームページ
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/pro-meta/
• [Remarks] ユビキチン化基質の効率的な同定法の開発
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2015/0331.html
• [Remarks] 難病"クッシング病"の原因遺伝子と発症機構を解明
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/topics/2014/1209.html
• [Patent(Industrial Property Rights)] A method for determining Ubiquitin chain length (2014)
  • Inventor(s): Yasushi Saeki et al
  • Industrial Property Rights Holder: Yasushi Saeki et al
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 14/533,182
  • Filing Date: 2014-11-05
  • Overseas