2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of biochemical methods to understand protein ubiquitylation
| Project Area | New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation |
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| Project/Area Number |
24112008
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
佐伯 泰 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, 副参事研究員 (80462779)
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| Project Period (FY) |
2012-06-28 – 2017-03-31
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| Keywords | ユビキチン / プロテアソーム / タンパク質分解 / 質量分析計 / 定量プロテオミクス / アフィニティープローブ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチンシグナルの全貌解明を目的とし、以下の研究を推進した。
1．質量分析によるユビキチン鎖の識別定量法の確立：これまでPRM法により、全てのユビキチンリンケージを超微量（100 amol）から絶対定量する系を確立し、領域内で見出された重要な基質のユビキチン鎖情報を得てきた。本年度はヒストンH3に付加されるユビキチン修飾、リボソームに付加されるユビキチン修飾等の解析に成功した。一方、領域内で見出されたK48/K63分岐型ユビキチン鎖の絶対定量系開発を共同で実施した。
2．ユビキチン結合タンパク質の網羅的解析：ユビキチン修飾系のデコーダー分子であるユビキチン結合タンパク質が細胞内で相互作用するユビキチン鎖を網羅的に定量解析することで、細胞内のユビキチンシグナルの使い分けを明らかにした。その結果、プロテアソームによるユビキチン化タンパク質の分解経路は、細胞内ではCdc48/p97とRad23を経由する間接的経路が主要であり、プロテアソーム分解のK48鎖選択性はCdc48のコファクターNpl4に依ることを明らかにした。
3．ホルマリン固定サンプルを用いた質量分析解析：ユビキチン結合タンパク質とユビキチン鎖、ユビキチンリガーゼと基質タンパク質、プロテアソームとその制御因子の相互作用は可逆的であり、従来の免疫沈降法では相互作用が失われてしまうことが多い。そこで、細胞を低濃度ホルマリンにより固定し、免疫沈降・質量分析解析に供す系を開発した。その結果、0.5～1％のホルマリン固定条件では3xFLAGタグによる免疫沈降が可能であり、基質タンパク質をbaitとしたユビキチンリガーゼの同定、プロテアソームをbaitとした結合タンパク質の同定、そしてユビキチン結合タンパク質をbaitとしたユビキチン鎖の絶対定量に成功した。よって、本方法はユビキチン研究をさらに進展させることが可能である。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] In Vivo Ubiquitin Linkage-type Analysis Reveals that the Cdc48-Rad23/Dsk2 Axis Contributes to K48-linked Chain Specificity of the Proteasome.2017
Author(s)
Tsuchiya, H., Ohtake, F., Arai, N., Kaiho, A., Yasuda, S., Tanaka, K., and Saeki, Y.
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Journal Title
Mol Cell
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Ankrd13 Family of Ubiquitin-interacting Motif-bearing Proteins Regulates VCP/p97-mediated Lysosomal Traffic of Caveolin-1.2016
Author(s)
Burana, D., Yoshihara, H., Tanno, H., Yamamoto, A., Saeki, Y., Tanaka, K., and Komada, M.
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Journal Title
J Biol Chem.
Volume: 291
Pages: 6218-6231
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] HTLV-1 Tax Induces Formation of the Active Macromolecular IKK Complex by Generating Lys63- and Met1-Linked Hybrid Polyubiquitin Chains.2016
Author(s)
Shibata, Y., Tokunaga, F., Goto, E., Komatsu, G., Gohda, J., Saeki, Y., Tanaka, K., Takahashi, H., Sawasaki, T., Inoue, S., Oshiumi, H., Seya, T., Nakano, H., Tanaka, Y., Iwai, K., and Inoue, J-I.
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Journal Title
PLoS Pathog.
Volume: 13
Pages: e1006162
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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